De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro

Het complexe proces van angiogenese verbetert en onderhoudt perfusie van het weefsel door het stimuleren van nieuw bloed vaartuig ontwikkeling van reeds bestaande therapieën¹. Het is een stevig gereglementeerde, evenwichtige proces door pro-angiogenic en anti-angiogenic factoren. Elke tekortkoming in dit systeem kan leiden tot onvoldoende schip onderhoud of groei, waardoor ernstige ischemische ziekten met inbegrip van het myocard en vaatziekten, beroerte en neurodegeneratieve aandoeningen. Echter is overdreven vasculaire ontwikkeling kenmerkend voor aandoeningen zoals kanker en inflammatoire aandoeningen,².

Het ontwikkelen van therapieën die gericht zijn op het bepalen van de angiogenese om gunstige weefselregeneratie is van cruciaal belang. Ondanks uitgebreide preklinische en klinische onderzoeken, zijn pogingen ter stimulering van de angiogenese met behulp van pro-angiogenic factoren en microRNAs mislukt om de gewenste resultaten^3,4,5. Mogelijke redenen voor de tijdelijke effecten omvatten: beperkte levensduur van angiogenic proteïnen en nucleïnezuren, en het eindige aantal gerichte groeifactoren^6,7. Hoewel oplosbaar angiogenic factoren essentieel zijn voor het initiëren van angiogenese, afhankelijk het onderhoud en de functionaliteit van therapieën van ondersteuning van celtypen, met inbegrip van pericytes en gladde spier cellen⁸. Het gebied van pro-angiogenic therapieën onderzoekt nu potentiële stamcellen en progenitor cel bronnen waarmee angiogenic factoren lokaal, terwijl het fysiek ondersteunen van nieuw ontwikkelde therapieën, zelf vernieuwen of zelfs differentiëren in Endotheel-achtige cellen^9,10. Het vinden van de optimale angiogenic celtypes met het vermogen om te voldoen aan deze functionele eisen houdt een grote belofte voor ischemische weefselregeneratie.

Om met succes vertalen potentiële cel-gebaseerde therapieën in de klinische proeven, moeten pre-klinische studies hun doelmatigheid aan te tonen en markeer de onderliggende mechanismen van de angiogenic. Ondanks het grote aantal gevestigde angiogenese testen, ontbreekt het veld een “gouden standaard” in vitro -assay die betrouwbaar kunt het evalueren van de werkzaamheid van potentiële kandidaat-cel typen^{11,12, 13}. meeste in vitro angiogenese testen (met inbegrip van het endotheel proliferatie, migratie en buis vorming testen) meestal beoordelen de effecten van cellen of verbindingen op de endotheliale cellen phenotypical wijzigingen of differentiatie in buisvormige en netwerk structuren^14,15. Terwijl deze functies essentieel voor angiogenese zijn, een ‘vertaalbare ‘ redactionele assay ook moet evalueren: 1) de vergroting of de vervanging van de ondersteunende celtypen, met inbegrip van pericytes of zachte spiercellen, 2) de verwerking van ECM en/of kelder membraan, en 3). de efficiëntie ter bevordering van de vorming van functionele microvasculature. In vivo angiogenese-modellen, met inbegrip van de cornea assay en Matrigel plug assay, de unieke in-vivo -communicatie recapituleren maar worden uitgedaagd door de moeilijkheid van tracking toegediend cellen te observeren van de fysieke interacties. Bovendien, in in-vivo modellen, xeno-immuun afwijzing kan optreden tijdens het testen van potentiële allogene cel therapie kandidaten¹⁶. Ex vivo angiogenese-modellen, met name de bepaling van de aorta ring kan bieden: 1) gemakkelijk observatie en kwantificering van buisvormige structuren, 2) accessoire ondersteunende cellen, 3) ECM van host en kunstmatige leveringen, 4) uitsluiting van inflammatoire onderdelen en 5) snelle en goedkope setup^17,18. Typisch, de aorta ring test kunt testen het angiogenic potentieel van kleine secretoire eiwitten, farmacologische agenten en transgene knaagdieren modellen^19,20,21.

MSCs zijn veelbelovende kandidaten voor vasculaire regeneratie voornamelijk via hun paracrine-gemedieerde effecten^22,23,24. MSCs is aangetoond dat ze afscheiden van belangrijke angiogenic factoren, met inbegrip van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), insuline-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) en angiopoeitin-1 (Ang-1)^{25 ,26}. MSCs kunnen ook detecteren en thuisbasis van ischemische of ontstoken weefsels, echter, de precieze mechanismen zijn nog onderzocht. In toenemende mate ondersteunt de literatuur de hypothese dat de meeste MSCs uit gerelateerde cellen voortvloeien, mede express pericyte markeringen en zich zoals pericytes^{27 gedragen kunnen}. HUCPVCs zijn een jonge bron van MSCs afgeleid van de gerelateerde regio van de menselijke navelstreng. Zij vertegenwoordigen een bevolking van MSCs met pericyte-achtige eigenschappen en van FTM zowel term umbilical koorden gekenmerkt. FTM HUCPVCs tonen een hoge expressie van pericyte markers, met inbegrip van CD146 en NG2, hoge proliferatieve en multilineage potentieel, immuun-bevoorrechte eigenschappen, en een robuuste paracrine profiel²⁸weer te geven. FTM HUCPVCs zijn een ideale kandidaat celtype ter bevordering van de regeneratie van de gewonde weefsel door het bevorderen van nieuwe therapieën via hun pericyte-achtige eigenschappen.

Om te testen het angiogenic potentieel en de pericyte-achtige eigenschappen van menselijke MSCs, zijn een zeer beperkt aantal angiogenese testen beschikbaar wanneer positieve angiotropic migratie (hierna te noemen “homing”), ECM, verwerking en ontwikkeling van fysieke interacties tussen celtypes kunnen worden onderzocht, terwijl het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de ontwikkeling van de microvasculature.

Hierbij presenteren wij een protocol dat wordt een nieuwe toepassing van de aorta ring test beschreven. Menselijke MSCs waren mede gekweekte met ontwikkelingslanden rat afkomstige aorta endothelial netwerken te beoordelen op hun bijdrage aan de vorming, rijping en homeostase buis. Deze versie van de aorta ring assay beoordeelt het vermogen en de potentie van cel therapie kandidaten home naar sites van angiogenese, voeren en bemiddelen van ECM verwerking, en bijdragen aan endothelial buisvormige ontwikkeling door middel van vaststelling van pericyte-achtige lichamelijke interacties. Naast het kwantificeren van het netto-effect van MSCs op in vitro endothelial netwerk vorming en observeren intercellulaire interacties, wij ook geoptimaliseerd een protocol om te isoleren MSCs uit co culturen. Door het uitvoeren van cytometry van de stroom- en qPCR, is het mogelijk om te karakteriseren wijzigingen in MSC fenotype en gen-expressie na co cultuur. Als model celtypes, vergeleken we ontogenetisch vroeg (prenatale) en eind (volwassen) bronnen van menselijke MSCs: FTM HUCPVCs en menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (BMSC), respectievelijk in de aorta ring test. Wij stellen voor dat de bepaling van de aorta ring kan worden gebruikt om te studeren het angiogenic potentieel van elk fysiek ondersteunende celtype wanneer onderzochte voor regeneratieve toepassingen van de angiogenic.