Hier, wordt een methode beschreven voor de bereiding van 3-dimensionale (3D) sferoïde co cultuur van pancreatic kankercellen en fibroblasten, gevolgd door meting van metabolische functies met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.
Vele soorten kanker, met inbegrip van alvleesklierkanker, hebben een dichte fibrotische stroma die een belangrijke rol in de progressie van de tumor en invasie speelt. Geactiveerde kanker geassocieerd fibroblasten zijn een essentieel onderdeel van het stroma tumor die interactief met kankercellen en bevordering van hun groei en overleving. Modellen die de interactie van kankercellen te recapituleren en fibroblasten geactiveerd zijn belangrijke hulpmiddelen voor de bestudering van de stromale biologie en voor ontwikkeling van antitumorale agenten. Hier wordt een methode beschreven voor de snelle generatie van robuuste 3-dimensionale (3D) sferoïde co cultuur van pancreatic kankercellen en geactiveerde alvleesklier fibroblasten, die kunnen worden gebruikt voor latere biologische studies. Bovendien is beschreven het gebruik van 3D spheroïden bij de uitvoering van functionele metabole tests om te sonderen cellulaire Bioenergetica trajecten met behulp van een extracellulaire flux analyzer gekoppeld aan een sferoïde microplate. Pancreatic kankercellen (Patu8902) en geactiveerde alvleesklier fibroblast cellen (PS1) waren samen gekweekt en gemagnetiseerde met behulp van een biocompatibele nanoparticle vergadering. Gemagnetiseerde cellen werden snel bioprinted met behulp van magnetische schijven in een 96 goed formaat, in groei media voor het genereren van spheroïden met een diameter variërend tussen 400-600 µm binnen 5-7 dagen van cultuur. Functionele metabole testen met behulp van Patu8902-PS1 spheroïden werden vervolgens uitgevoerd met behulp van de technologie van de extracellulaire flux sonde cellulaire energetische routes. De methode hierin is eenvoudig, kunt consistente generatie van kanker cel-fibroblast sferoïde co culturen en kan mogelijk aangepast worden aan andere celtypes kanker op optimalisatie van de huidige beschreven methodologie.
In het laatste decennium, zijn talrijke in vitro 3D-modellen ontwikkeld om te recapituleren en onderzoeken de in vivo tumor biologie, communicatie en groei omstandigheden van kanker cellen1,2. Tweedimensionale (2D) enkelgelaagde cel cultuur systemen met uniforme blootstelling aan biochemische factoren en geneesmiddelen verbindingen niet om te repliceren de native 3D stromale tumor interacties blootgesteld op een helling van verbindingen verspreiden via de extracellulaire matrix (ECM) eiwitten3,4. Dus, in vergelijking met 2D weefselkweek modellen, 3D kanker modellen hebben naar voren gekomen om aan te tonen beter potentiële bij het simuleren van de communicatie van de tumor en diende als belangrijke instrumenten beter te begrijpen in vivo tumor kenmerken, zoals hypoxie, desmoplasia, rustperiode, drug doordringendheid, toxiciteit en therapeutische weerstand5,6. Te dien einde hebben 3D-modellen potentieel om de kloof tussen 2D celkweek en hele dierlijke modellen door het nabootsen van in vivo de functies van de tumor, terwijl relatief goedkope en geoptimaliseerd voor snelle generatie en consistentie. Deze voordelen worden uitgebuit om te versnellen translationeel onderzoek op vele gebieden waaronder Kankerbiologie, genuitdrukking en weefsel engineering7,8.
In een sterke stijging van de zich ontwikkelende 3D weefselkweek methoden, magnetische levitatie technieken zijn onlangs ontwikkeld en beschreven voor groei, analyseren en beeldvorming van spheroïden afgeleid van verschillende cel typen9,10, 11 , 12. magnetische 3D bioprinting exploiteert het gebruik van magnetische krachten om ingenieur weefsels door cellen met biocompatibel nanodeeltjes magnetiseren en af te drukken in multi goed formaten. Hierdoor kan de snelle productie van consistente, in de buurt van identieke 3D spheroïden, die kunnen worden aangewend en werkzaam voor een overvloed van downstream toepassingen voor biochemische en biofysisch onderzoek10. Hier hebben we de techniek van de magnetische bioprinting met behulp van een biocompatibel materiaal genaamd Nanoshuttle (NS) samengesteld van ijzeroxide, poly L-lysine en gouden nano deeltjes op het etiket van pancreatic kankercellen en fibroblasten aangepast. NS hecht via een elektrostatisch proces aan het plasma-membraan, is niet bekend om te binden aan een specifieke receptoren en releases uit de cel oppervlakte binnen een week. Het zeer lage magnetische krachten (30pN) vereist, genoeg om aggregaat maar niet kwaad cellen en heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van de cellen, metabolisme of verspreiding te maken zeer biocompatibel voor 3D culturen10,13,14 ,15.
In deze studie, beschrijven met behulp van pancreatic kanker als een voorbeeld en model, we de generatie en metabole kwantitatieve analyse van 3D kanker cel-fibroblast spheroïden. Vanaf cellen gekweekt in 2D vaartuigen, illustreren we de cultuur en groei omstandigheden van de alvleesklier tumor-fibroblast co cultuur spheroïden met behulp van magnetische bioprinting. Gekweekte spheroïden werden vervolgens gebruikt in functionele metabole testen met behulp van een extracellulaire flux-analyzer, een technologie aangetoond dat zij tegelijkertijd maatregel de twee grote energie produceren trajecten, glycolyse en mitochondriale ademhaling, in een verscheidenheid van levende cellen en weefsels16,17,18,19,20. Glycolyse werd gemeten als een verandering in het tarief van de extracellulaire verzuring (ECAR), terwijl de mitochondriale ademhaling of oxidatieve fosforylatie werd gemeten als zuurstof verbruik tarief (OCR). Wij stellen voor dat deze methode ontwikkeld voor de alvleesklier tumor spheroïden als backbone dienen kan voor het optimaliseren en vertalen van 3D tumor sferoïde generatie en kwantitatieve analyse aan andere cel/weefseltypes (HLA).
Met behulp van pancreatic kanker, de 3rd leidt oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten24, als een voorbeeld en model, een snelle en consistente methode is ontwikkeld om te groeien en assay 3D spheroïden met behulp van de co cultuur van pancreatic kankercellen en alvleesklier fibroblasten geactiveerd. Met behulp van magnetische bioprinting, werden spheroïden, variërend in grootte van 400-600 µm in diameter verkregen. Deze werden onderworpen aan metabole testen om de functionaliteit van de gekweekte 3D spheroïden met succes te testen. Deze methode is eenvoudig, consistente en kan gemakkelijk aangepast worden aan andere celtypes.
Terwijl deze methodologie zal versnellen en aan de translationeel waarde van de tests uitgevoerd met 3D spheroïden toevoegen, kan het worden verbeterd door de ontwikkeling van technieken waarmee multiplexing van sferoïde manipulatie en behandeling. Dit moet verder verminderen de totale tijd, kosten en arbeid vereist voor het uitvoeren van de test. Bovendien mogen sferoïde volumes te normaliseren OCR signalen zoals gerapporteerd door anderen6worden gebruikt. Sferoïde volume genormaliseerd door de gemiddelde omvang van een cel kan worden gebruikt om te bepalen van OCR per cel, maar aangezien groei van spheroïden niet identiek zijn zal, berekenen van een absolute OCR per cel kan lastig zijn. Momenteel wordt deze methodologie beperkt door het ontbreken van een doeltreffend instrument multiplex sferoïde behandeling en overdracht van groei platen te assay milieu.
De beschreven methode is gewijzigd en aangepast aan het magnetische bioprinting technology en verder gevalideerd om aan te tonen van de functionele relevantie door de gekweekte spheroïden toe te passen op een stroomafwaartse metabole test. De methode is een belangrijk instrument voor het genereren van robuuste, levensvatbare en functionele spheroïden, waarin de twee grote celtypes gevonden in de meeste weefsels van de tumor, kankercellen en kanker geassocieerd fibroblasten, die kunnen worden ingezet voor andere geneesmiddelen testen, zoals drug schermen. Het relatieve gemak en efficiëntie van de NS-methodologie is een belangrijke verbetering via andere methoden25, zoals de opknoping drop methode2,26 van sferoïde generatie.
Robuuste spheroïden gegenereerd als zodanig bieden een in vitro tumor model dat stromale cellen, die vaak in vele 3D Cultuurwetenschappen ontbreken bevat. De mogelijkheden voor de toepassing van 3D sferoïde modellen gegenereerd als zodanig zijn enorm. Dergelijke modellen kunnen bijvoorbeeld worden ingezet te onderzoeken van cel-cel interacties, Bioenergetica verschuivingen en genetische gevoeligheid en afhankelijkheid van de verschillende therapeutische regimes te testen. 3D spheroïden die de tumor in vivo communicatie recapituleren dienen als zeer relevant en nuttig hulpmiddel voor drug screening studies en die onderzoek naar de mechanismen van de actie van huidige en nieuwe therapeutics. Metabole testen indringende energie trajecten met behulp van spheroïden culturen met mutantcellen kunnen helpen werpen nieuw licht in de rol van deze genen en verwante trajecten in de pathobiology in een relevante 3D-model van kanker, als de spheroïden beschreven in deze studie.
De succesvolle toepassing van deze methode is vooral afhankelijk van de gezondheid van de cellen die nodig zijn voor magnetische afdrukken, dat is de reden waarom cel groeien in logaritmische fase moet worden geoogst en gemagnetiseerde. Het is cruciaal voor de magnetische sferoïde-schijf gebruiken om af te drukken gemagnetiseerde cellen en niet het bedrijf rijden, die alleen tijdens de sferoïde wassen en media aanvullen van de stappen van de beschreven methode moet worden gebruikt. Het andere belangrijkste aspect voor succesvolle uitlezing van metabole testen is het handhaven van de morfologie van de spheroïden tijdens het overdrachtproces van de groeischijf tot de assay-plaat.
Globaal, is dit protocol opgezet voor generatie van 3D spheroïden die zowel kanker en stromale cellen, na de daaropvolgende metabole kwantitatieve analyse van de spheroïden met de extracellulaire flux analyzer bevatten. De belangrijkste kenmerken van deze methode zijn dat het is snel, eenvoudig aan te passen en consistente, relevante en de tumor in vivo communicatie bootst, relatief goedkoop is en als een nieuw hulpmiddel dienen kan voor de studie van biologie van de tumor en het ontwikkelen van antikanker agenten.
The authors have nothing to disclose.
We zouden graag bedanken Samuel Zirbel voor hulp bij het optimaliseren van de kweekomstandigheden en monitoring sferoïde groei. We zijn dankbaar Agilent technologies voor het verstrekken van de SeaHorse XFe96 analyzer, assay reagentia en technische inzichten. Wij danken ook Dr. Hemant Kocher bij Barts Cancer Institute in Nederland voor het verstrekken van de PS1-cellen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Seena Magowitz Foundation voor alvleesklier kankeronderzoek en een staan tot kanker-kanker onderzoek UK-Lustgarten Stichting Pancreatic kanker Dream Team onderzoeksbeurs (Grant nummer: SU2C-AACR-DT-20-16). Staan tot kanker is een programma van de Entertainment industrie Stichting. Onderzoekssubsidies worden beheerd door de American Association for Cancer Research, de wetenschappelijke partner van SU2C.
0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
D-Glucose | Sigma | D9434 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C |
Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |