الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية
概要
هنا، يتم وصف أسلوب للتحضير لثقافة المشارك كروي ثلاثي الأبعاد (3D) لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية، متبوعاً بقياس وظائف الأيضية باستخدام محلل الجريان خارج الخلية.
Abstract
العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك سرطان البنكرياس، وقد ستروما تليفية كثيفة التي تلعب دوراً هاما في تطور الورم والغزو. الليفية المنشط السرطان المرتبطة هي عنصر رئيسي ستروما الورم التي تتفاعل مع الخلايا السرطانية ودعم النمو والبقاء على قيد الحياة. نماذج الخص التفاعل بين الخلايا السرطانية وتنشيط الخلايا الليفية أدوات هامة لدراسة البيولوجيا stromal وتنمية عوامل انتيتومور. هنا، يتم وصف طريقة لتوليد ثقافة قوية كروي (3D) ثلاثي الأبعاد المشارك من خلايا سرطان البنكرياس وتنشيط الخلايا الليفية البنكرياس التي يمكن استخدامها في الدراسات البيولوجية اللاحقة السريع. بالإضافة إلى ذلك، وصف استخدام 3D الماغنيسيوم في القيام بفحوصات الأيض الفنية للتحقيق في سبل الاستقلاب الخلوي استخدام محلل الجريان خارج الخلية يقترن صفيحة كروي. خلايا سرطان البنكرياس (Patu8902) والخلايا تنشيط البنكرياس تنتجها الخلايا الليفية (PS1) قد شارك مثقف وممغنط استخدام جمعية نانوحبيبات متوافق حيويا. وكانت الزنزانات ممغنط سرعة بيوبرينتيد باستخدام محركات الأقراص المغناطيسية في شكل جيد 96، في وسائط النمو لتوليد الماغنيسيوم يبلغ قطرها يتراوح بين 400-600 ميكرون في غضون 5-7 أيام للثقافة. وأجريت فحوصات الأيض الوظيفية باستخدام Patu8902-PS1 الماغنيسيوم ثم استخدام تقنية الجريان خارج الخلية لسبر مسارات حيوية الخلوية. الأسلوب هنا بسيطة ويتيح الجيل متسقة من سرطان الخلية-تنتجها الخلايا الليفية كروي الثقافات المشتركة ويمكن تكييفه محتملة أخرى أنواع الخلايا السرطان عند تحسين المنهجية الحالية لوصف.
Introduction
في العقد الماضي، وضعت العديدة في المختبر نماذج ثلاثية الأبعاد الخص والتحقيق في فيفو ورم المكروية، والبيولوجيا والنمو ظروف سرطان خلايا1،2. ثنائي الأبعاد (2D) أحادي الطبقة خلية ثقافة تفشل الأنظمة مع موحدة من التعرض للعوامل الكيميائية الحيوية ومركبات الفحص لتكرار التفاعلات ورم stromal 3D الأصلي يتعرض لتدرج للمركبات التي تم نشرها من خلال الخلية مصفوفة البروتينات (ECM)3،4. وهكذا، بالمقارنة مع نماذج 2D زراعة الأنسجة، والسرطان 3D نماذج ظهرت لإظهار أفضل المحتملة في محاكاة ورم المكروية وخدم كأدوات هامة لتحسين فهم في فيفو خصائص الورم، مثل نقص، ديسموبلاسيا والسكون، بينيترانسي المخدرات، وسمية والمقاومة العلاجية5،6. وتحقيقا لهذه الغاية، إمكانيات نماذج ثلاثية الأبعاد سد الفجوة بين الثقافة خلية ثنائية الأبعاد ونماذج حيوانية كله عن طريق محاكاة في فيفو ميزات الورم، بينما يجري غير مكلفة نسبيا والأمثل لتوليد السريع والاتساق. يجري استغلال هذه المزايا لتسريع البحوث متعدية الجنسيات في العديد من المجالات بما في ذلك سرطان علم الأحياء و morphogenesis والأنسجة الهندسة7،8.
في موجه من تطور أساليب زراعة أنسجة ثلاثية الأبعاد، مؤخرا تم تطوير تقنيات الاسترفاع المغنطيسي ووصف للنمو، المعايرة والتصوير من الماغنيسيوم المستمدة من مختلف الخلية أنواع9،10، 11 , 12-بيوبرينتينج 3D المغناطيسي يستغل استخدام القوى المغناطيسية هندسة الأنسجة بجذب الخلايا مع جسيمات نانوية متوافق حيويا وطباعتها في تنسيقات متعددة جيدا. وهذا يسمح للإنتاج السريع ليتمشى، قرب الماغنيسيوم 3D متطابقة، التي يمكن تسخيرها واستخدامها لعدد كبير تطبيقات المتلقين للمعلومات للتحقيق البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية10. هنا أننا قد تكيفت تقنية بيوبرينتينج المغناطيسي باستخدام مادة متوافق حيويا يسمى نانوشوتلي (NS) تتألف من أكسيد الحديد، وبولي L-يسين وجسيمات نانو الذهب لتسمية خلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية. تولي NS الكهربية الاستاتية لغشاء البلازما، غير معروف لربط أي مستقبلات محددة، والنشرات خارج الخلية السطحية في غضون أسبوع. أنه يتطلب قوات مغناطيسية منخفضة جداً (30pN)، وما يكفي للتجميع ولكن الضرر لا خلايا ولا يؤثر على بقاء الخلية، والايض أو انتشار لجعله متوافق حيويا جداً للثقافات 3D10،13،14 ،15.
في هذه الدراسة، باستخدام سرطان البنكرياس كمثال ونموذج، ونحن وصف جيل والفحص الأيضي من 3D سرطان الخلية-تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم. بدءاً من الخلايا المستزرعة في 2D السفن، نحن لتوضيح ظروف الثقافة ونمو ورم البنكرياس-تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم ثقافة المشارك باستخدام بيوبرينتينج المغناطيسي. ثم استخدمت الماغنيسيوم المستزرعة في فحوصات الأيض الوظيفية باستخدام محلل الجريان خارج الخلية، أثبتت تقنية للتدبير في نفس الوقت مسارين المنتجة الكبرى لتوليد الطاقة، وتحلل والتنفس المتقدرية، في مجموعة متنوعة من العيش الخلايا والأنسجة16،،من1718،،من1920. وتم قياس تحلل كتغير في معدل تحمض خارج الخلية (عكر)، في حين تم قياس التنفس المتقدرية أو الفسفرة كمعدل استهلاك الأوكسجين (OCR). ونحن نقترح أن هذا الأسلوب الماغنيسيوم ورم البنكرياس يمكن بمثابة العمود الفقري للاستفادة المثلى وترجمة جيل كروي الورم 3D ومقايسة لأنواع الخلايا/أنسجة أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام سرطان البنكرياس، 3rd يؤدي سبب الإصابة بسرطان المتعلقة بالوفيات في الولايات المتحدة وضعت24، كمثال ونموذج، طريقة سريعة ومتسقة لتنمو والاعتداء الماغنيسيوم ثلاثي الأبعاد باستخدام ثقافة المشارك من خلايا سرطان البنكرياس و تنشيط البنكرياس الليفية. استخدام بيوبرينتينج المغناطيسي، وتم الحصول على الماغنيسيوم يتراوح حجمها بين 400-600 ميكرون في القطر. وهذه قد تعرضوا لفحوصات الأيضية لاختبار الأداء الوظيفي لالماغنيسيوم 3D مثقف بنجاح. هذه الطريقة بسيطة ومتسقة ويمكن تكييفها بسهولة لأنواع الخلايا الأخرى.
بينما سيتم التعجيل بهذه المنهجية وإضافة إلى قيمة متعدية لفحوصات يؤديها مع الماغنيسيوم 3D، يمكن تحسينها بتطوير التقنيات التي تسمح للإرسال المتعدد للتلاعب كروي والتعامل معها. هذا وينبغي مواصلة تخفيض الوقت الكلي، التكلفة والعمالة اللازمة للاضطلاع التحليل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام وحدات التخزين كروي لتطبيع إشارات التعرف الضوئي على الحروف كما أفاد البعض الآخر6. حجم كروي تطبيع بمتوسط حجم خلية يمكن أن تستخدم لتحديد التعرف الضوئي على الحروف كل خلية، ولكن نظراً لنمو الماغنيسيوم لن تكون متطابقة، حساب مطلق التعرف الضوئي على الحروف كل خلية قد تكون صعبة. حاليا، وهذه المنهجية يحد الافتقار إلى أداة فعالة لمعالجة كروي متعدد ونقل من لوحات النمو الاعتداء على البيئة.
تعديل الأسلوب الموصوفة ومقتبس من التكنولوجيا بيوبرينتينج المغناطيسي، وكذلك التحقق من صحة لإظهار صلة وظيفية بتطبيق الماغنيسيوم مثقف فحص أيضي المتلقين للمعلومات. الأسلوب الذي يوفر أداة هامة لتوليد الماغنيسيوم قوية وقادرة على البقاء والوظيفية التي تحتوي على هذين النوعين الخلية الرئيسية الموجودة في معظم أنسجة الورم والخلايا السرطانية والسرطان المرتبطة الليفية، التي يمكن أن تستخدم لفحوصات أخرى الفحص، مثل شاشات المخدرات. بسهولة نسبية وكفاءة المنهجية NS تحسن كبير على أساليب أخرى25، مثل إسقاط الشنق الأسلوب2،26 من جيل كروي.
الماغنيسيوم القوية التي تم إنشاؤها على هذا النحو توفر نموذج ورم في المختبر الذي يتضمن الخلايا اللحمية، التي غالباً ما تكون مفقودة من دراسات الثقافة 3D كثيرة. إمكانيات تطبيق نماذج كروي ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها على هذا النحو واسعة. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه النماذج للتحقيق-خلية التفاعلات، تحولات الاستقلاب واختبار القابلية الوراثية والتبعية للأنظمة العلاجية المختلفة. الماغنيسيوم 3D أن الخص في فيفو وورم المكروية كأداة هامة ومفيدة جداً للمخدرات فحص الدراسات والدراسات التي تحقق آليات العمل من العلاجات الحالية والجديدة. فحوصات الأيض سبر مسارات الطاقة باستخدام الماغنيسيوم قد تساعد الثقافات مع خلايا متحولة ضوءا جديداً إلى دور تلك الجينات ومسارات ذات الصلة في بل في نموذج ثلاثي الأبعاد ذات صلة بالسرطان، مثل الماغنيسيوم الموصوفة في هذه الدراسة.
التطبيق الناجح لهذا الأسلوب يعتمد قبل كل شيء على صحة الخلايا المطلوبة للطباعة المغناطيسية، ولهذا السبب ينبغي أن تحصد الخلية تنمو في المرحلة لوغاريتمي وممغنط. من المهم استخدام محرك الأقراص الممغنطة كروي لطباعة الخلايا الممغنطة وليس إجراء محرك الأقراص، التي ينبغي أن تستخدم فقط أثناء الغسيل كروي وتجديد خطوات الأسلوب وصف وسائل الإعلام. الجانب الآخر الأكثر أهمية لقراءات ناجحة لفحوصات الأيض الحفاظ على مورفولوجية الماغنيسيوم أثناء عملية النقل من لوحة النمو إلى لوحة المقايسة.
وبوجه عام، أنشئت هذا البروتوكول لجيل الماغنيسيوم ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على السرطان والخلايا اللحمية، بعد الفحص الأيضي اللاحقة من الماغنيسيوم استخدام محلل الجريان خارج الخلية. الميزات الرئيسية لهذا الأسلوب هي أن سريعة، وقابلة للتكيف بسهولة ومتسقة وذات الصلة إلى ويحاكي في فيفو وورم المكروية وغير مكلفة نسبيا وقد تخدم كأداة جديدة لدراسة البيولوجيا الورم ووضع السرطان وكلاء.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر صمويل زيربيل للمساعدة في تحسين أحوال الثقافة ورصد النمو كروي. ونحن ممتنون للتكنولوجيات اجيلنت لتوفير محلله96 XF فرس البحر، والكاشفات المقايسة والرؤى الفنية. كما نشكر الدكتور هيمانت كوخر بارتس معهد السرطان في المملكة المتحدة لتوفير خلايا PS1. تأييد هذا العمل جزئيا من مؤسسة ماجوويتز سينا لأبحاث سرطان البنكرياس والوقوف يصل إلى السرطان-سرطان لوستجارتين المملكة المتحدة مؤسسة البنكرياس السرطان حلم فريق البحوث منحة بحثية (عدد المنح: SU2C-آكر-DT-20-16). نقف للسرطان برنامج “مؤسسة صناعة الترفيه”. المنح البحثية تدار بواسطة “الرابطة الأمريكية” “بحوث السرطان”، الشريك العلمي ل SU2C.
Materials
| 0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
| 96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
| Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| D-Glucose | Sigma | D9434 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
| Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C |
| Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
| PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
| RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
| SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |
参考文献
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).
- Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
- Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).
- Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
- Tseng, H., et al. . Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , 1-9 (2015).
- Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).
- Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
- Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
- Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
- Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).
- Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer’s molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).
- Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer’s sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
