הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts
概要
כאן, שיטה מתוארת עבור הכנת ספרואיד תלת-ממדי (3D) תרבות משותפת של תאי סרטן הלבלב ו fibroblasts, ואחריו מדידה של פונקציות מטבוליות באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.
Abstract
סוגי סרטן רבים, לרבות סרטן הלבלב, יש של משתית שהותירה צפוף זה ממלא תפקיד חשוב ב התקדמות הגידול, הפלישה. מופעל סרטן הקשורים fibroblasts הם מרכיב מרכזי של stroma הגידול אינטראקציה עם תאים סרטניים ולתמוך שלהם וצמיחה של הישרדות. בדגמי לסכם את האינטראקציה של תאים סרטניים ומופעל fibroblasts הן כלי חשוב עבור לימוד הביולוגיה סטרומה, פיתוח של סוכנים antitumor. . הנה, שיטה מתואר לדור מהירה של תרבות משותפת חזקים ספרואיד תלת-ממדי (3D) של תאי סרטן הלבלב ו fibroblasts הלבלב מופעל יכול לשמש עבור מחקרים ביולוגיים מאוחרים יותר. בנוסף, תיאר השימוש spheroids 3D בביצוע מבחני מטבולית תפקודית כדי לחקור מסלולים ביואנרגיה הסלולר באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית מזווג עם microplate ספרואיד. תאי סרטן הלבלב (Patu8902) ואת תאי פיברובלסט הלבלב מופעל (PS1) היו תרבותי משותף, הממוגנטים באמצעות אסיפה nanoparticle מסתיימים. תאים magnetized היו במהירות bioprinted באמצעות כוננים מגנטי בתבנית טוב 96, בתקשורת הצמיחה כדי ליצור spheroids בקוטר הנע בין 400-600 מיקרומטר תוך 5-7 ימים של תרבות. פונקציונלי מבחני מטבולית באמצעות spheroids Patu8902-PS1 בוצעו מכן בטכנולוגיה השטף חוץ-תאית כדי לחקור הסלולר מסלולים אנרגטיים. השיטה בזאת היא פשוטה, מאפשר דור עקבית של סרטן התא-פיברובלסט ספרואיד תרבויות משותף, ניתן להתאים באופן פוטנציאלי סוגי תאים אחרים סרטן על אופטימיזציה של המתודולוגיה המתוארת הנוכחי.
Introduction
בעשור האחרון, רבים במבחנה דגמי תלת-ממד פותחו מסכם את הדברים ולחקור ויוו הגידול ביולוגיה, microenvironment וצמיחה התנאים של סרטן תאים1,2. מימדי חד שכבתי (2D) תא תרבות מערכות עם חשיפה אחידה גורמים ביוכימיים ותרכובות לניסויים קליניים להיכשל כדי לשכפל את האינטראקציות יליד הגידול-סטרומה 3D חשוף הדרגתי של תרכובות לשדר דרך חוץ-תאית מטריקס חלבונים (ECM)3,4. לפיכך, לעומת מודלים תרביות רקמה 2D, סרטן תלת-ממד מודלים יש בקע להראות טוב יותר פוטנציאל-המדמה את microenvironment הגידול ושימש כלי חשוב יותר להבין ויוו הגידול מאפיינים, כגון היפוקסיה, desmoplasia, תרדמה, סמים penetrance, רעילות, התנגדות טיפולית5,6. לשם כך, דגמי תלת-ממד יש פוטנציאל כדי לגשר על הפער בין תרבות תא 2D כל בבעלי חיים על ידי מחקה ויוו תכונות הגידול, בעת היותו זול יחסית, ממוטב עבור הדור מהירה ועקביות. יתרונות אלה אינן מנוצלות כדי להאיץ את המחקר translational בתחומים רבים, כולל סרטן ביולוגיה, מורפוגנזה רקמות הנדסה7,8.
נחשול של התפתחו שיטות של תרביות רקמה תלת-ממד, טכניקות ריחוף מגנטי יש לאחרונה פותחה, תיאר לצמיחה, assaying והדמיה של spheroids נגזר שונים תא סוגי9,10, 11 , 12. bioprinting 3D מגנטי מנצלת את השימוש כוחות מגנטיים להנדס רקמות magnetizing תאים עם חלקיקים מסתיימים, להדפיס אותן בתבניות רב טוב. דבר זה מאפשר ייצור מהיר של עקבי, ליד זהה spheroids 3D, אשר ניתן לרתום מועסק שפע של יישומים במורד הזרם החקירה הביוכימי, biophysical10. כאן אנחנו הסתגלו הטכניקה bioprinting מגנטי באמצעות מסתיימים חומר שנקרא Nanoshuttle (אן אס) המורכב של תחמוצת ברזל, פוליפוני L-ליזין, חלקיקי ננו זהב לסמן תאים סרטן הלבלב ו fibroblasts NS מייחס electrostatically את קרום פלזמה, לא ידוע להיקשר לקולטנים ספציפיים כלשהם, משחרר את התא על פני השטח תוך שבוע. זה דורש כוחות מגנטיים נמוך מאוד (30pN), מספיק כדי צבירה אבל לא לפגוע תאים, אינה משפיעה על יכולת הקיום תא בחילוף החומרים או התפשטות להצליח מאוד מסתיימים עבור תלת-ממד תרבויות10,13,14 ,15.
במחקר זה, באמצעות סרטן הלבלב כמו דוגמה ומודל, נתאר את הדור ואת וזמינותו מטבולית של סרטן 3D פיברובלסט תא spheroids. החל מ תאים תרבותי בכלי 2D, אנו ממחישים את התנאים גדילה והתרבות של הגידול בלבלב-פיברובלסט תרבות משותפת spheroids באמצעות bioprinting מגנטי. Spheroids בתרבית ואז שימשו פונקציונלי מבחני מטבולית באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית, טכנולוגיה הפגינו כדי למדוד בו זמנית את שני מסלולים בהפקת האנרגיה הגדולות, גליקוליזה, נשימה מיטוכונדריאלי, במגוון בשידור חי תאים ורקמות16,17,18,19,20. גליקוליזה נמדדה בשינוי קצב חוץ-תאית acidification (ECAR), ואילו נשימה מיטוכונדריאלי או זרחון חמצוני נמדדה כמו קצב צריכת החמצן (OCR). אנו מציעים כי שיטה זו פותחה עבור בלבלב spheroids יכול לשמש עמוד השדרה עבור מיטוב ותרגום הגידול 3D ספרואיד הדור ואת וזמינותו לסוגי תאים/רקמה אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות סרטן הלבלב, 3רואד מוביל הגורם לסרטן מקרי מוות הקשורים בארצות הברית24, כגירסה מודל, שיטה מהירה ועקבית פותחה כדי לגדול ואת וזמינותו spheroids תלת-ממד באמצעות תרבות משותפת של תאי סרטן הלבלב ו הפעלת fibroblasts הלבלב. שימוש bioprinting מגנטי, spheroids החל בגודל של 400-600 מיקרומטר בקוטר התקבלו. אלה היו נענשים מבחני מטבולית לבחון בהצלחה את הפונקציונליות של spheroids תלת-ממד תרבותי. שיטה זו פשוטה, עקבית, ניתן להתאים בקלות סוגי תאים אחרים.
בעוד מתודולוגיה זו להאיץ ולהוסיף לערך translational של מבחני הופיעה עם spheroids תלת-ממד, ניתן לשפר על ידי פיתוח טכניקות המאפשרות ריבוב של מניפולציה ספרואיד וטיפול. זה אמור לצמצם עוד יותר את הזמן הכולל, עלות ועבודה הדרושים לביצוע וזמינותו. בנוסף, ניתן להשתמש ספרואיד כרכים לנרמל את אותות OCR כפי שדווח על-ידי אחרים6. נפח ספרואיד מנורמל לפי נפח ממוצע של תא יכול לשמש כדי לקבוע OCR בכל תא, אך כיוון הצמיחה של spheroids לא יהיו זהים, חישוב של OCR מוחלטת בכל תא עשויה להיות מאתגרת. כיום, מתודולוגיה זו מוגבל על ידי חוסר של כלי יעיל הטיפול ספרואיד מולטיפלקס, העברה של צלחות צמיחה assay סביבה.
השיטה המתוארת שונה, הותאם טכנולוגיה מגנטית bioprinting, קיבלו משנה תוקף, כדי להראות את הרלוונטיות פונקציונלי על-ידי החלת את spheroids בתרבית וזמינותו מטבולית במורד הזרם. השיטה מספקת כלי חשוב כדי ליצור spheroids חזקים, מעשית ופונקציונלית מכילים שני סוגי תאים עיקריים נמצאו ברוב גידול רקמות, תאים סרטניים, סרטן הקשורים fibroblasts, אשר יכול להיות מועסק על מבחני לניסויים קליניים אחרים, כגון מסכי סמים. בקלות יחסית והיעילות של המתודולוגיה NS היא שיפור משמעותי על פני שיטות אחרות25, כגון התליה זרוק שיטה2,26 ספרואיד הדור.
Spheroids חזקים שנוצר ככזה מספקים במבחנה הגידול מודל הכולל סטרומה תאים, אשר לעתים קרובות חסרים מחקרים 3D תרבות רבים. האפשרויות עבור יישום של דגמי תלת-ממד ספרואיד שנוצר ככזה עצומים. לדוגמה, מודל שכזה יכול להיות מועסק לחקור תא-תא אינטראקציות, ביואנרגיה משמרות וכדי לבדוק רגישות גנטית ואת התלות של משטרי טיפוליים שונים. Spheroids תלת-ממד זה מסכם את הדברים microenvironment הגידול ויוו לשמש כלי מאוד רלוונטי ושימושי עבור סמים הקרנת מחקרים ואלה חוקרים את מנגנוני הפעולה של הרפוי הנוכחי ואת הרומן. מבחני מטבולית בודק את המסלולים אנרגיה באמצעות spheroids תרבויות עם תאים המוטציות עשוי לעזור לשפוך אור חדש לתפקיד. של גנים אלה מסלולים הקשורים ב pathobiology של דגם תלת-ממד הרלוונטיים של סרטן, כמו את spheroids המתוארים במחקר זה.
יישום מוצלח של שיטה זו נשענת בראש ובראשונה על הבריאות של התאים הדרושה להדפסה מגנטי, ובגלל זה צריך להיות שנקטפו, הממוגנטים תא גדל בשלב לוגריתמי. חיוני להשתמש בכונן ספרואיד מגנטי כדי להדפיס תאים magnetized לא הכונן אחזקות, אשר אמור להיות מנוצל רק במהלך הכביסה ספרואיד ומדיה חידוש מדרגות השיטה המתוארת. ההיבט הכי קריטי אחרים לבדיקה מוצלחת של מבחני מטבולית היא לשמור על המורפולוגיה של spheroids במהלך תהליך ההעברה מהצלחת צמיחה לצלחת וזמינותו.
בסך הכל, פרוטוקול זה הוקם עבור הדור של תלת-ממד spheroids המכילים סרטן וגם תאי סטרומה, בעקבות וזמינותו מטבולית עוקבות של spheroids שימוש במנתח השטף חוץ-תאית. התכונות העיקריות של שיטה זו הן כי זה מהיר, להתאמה בקלות ולא עקבי, הרלוונטיים מחקה את microenvironment הגידול ויוו , זולה יחסית, עשוי לשמש כלי חדש עבור הלומדים ביולוגיה הגידול ופיתוח נגד סרטן סוכנים.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות זירבל שמואל לסיוע וניטור ספרואיד צמיחה של אופטימיזציה של תרבות תנאים. אנחנו אסירי תודה לטכנולוגיות Agilent למתןe96 מנתח את XF סוסון ים, ריאגנטים assay, תובנות טכני אנו מודים גם קוקר Hemant ד ר במכון הסרטן בארטס בבריטניה למתן התאים PS1. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי קרן Magowitz ראיתי עבור עמוד עד סרטן-סרטן בריטניה-: טיירגרטן קרן הלבלב סרטן החלום צוות מחקר במענק מחקר ומחקר סרטן הלבלב (גרנט המספר: SU2C-AACR-DT-20-16). לעמוד עד סרטן היא תוכנית של קרן תעשיית הבידור. מענקי מחקר מנוהלים על ידי האגודה האמריקאית לחקר הסרטן, מדעית, שותפו של SU2C.
Materials
| 0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
| 96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
| Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| D-Glucose | Sigma | D9434 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
| Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C |
| Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
| PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
| RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
| SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |
参考文献
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).
- Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
- Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).
- Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
- Tseng, H., et al. . Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , 1-9 (2015).
- Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).
- Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
- Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
- Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
- Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).
- Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer’s molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).
- Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer’s sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
