本文介绍了一种制备3维 (3D) 椭球共培养胰腺癌细胞和成纤维细胞的方法, 其次是利用细胞外流量分析仪测量代谢功能。
很多种癌症,包括胰腺癌,有致密的纤维基质中发挥重要的作用,在肿瘤的生长和侵袭。活化的癌相关成纤维细胞是肿瘤基质与肿瘤细胞相互作用和支持他们的成长和生存的关键组成部分。复述的癌症细胞相互作用并激活成纤维细胞的模型是为基质的生物学研究和开发的抗肿瘤药物的重要工具。 在这里,一种方法快速生成的鲁棒的三维 (3D) 球体共同文化的胰腺癌细胞和活化胰腺的成纤维细胞,可以用于随后的生物研究。此外,描述 3D 球体进行功能代谢的检测方法,探讨细胞生物能量通路使用胞外通量分析仪的使用与配对球体微孔板。胰腺癌细胞 (Patu8902) 和激活胰腺成纤维细胞 (PS1) 共同培养和磁化使用生物相容性纳米粒子组装。磁化的细胞迅速被罗使用 96 井格式,在生长介质生成球体直径为 5-7 天的文化内 400-600 微米之间的磁驱动器。使用 Patu8902 PS1 球体的功能代谢检测然后进行了利用胞外通技术探讨细胞能量的途径。此处是简单允许一致产生的癌症细胞成纤维细胞球体共同文化、 方法可以潜在地适应当前的描述方法优化后其他癌症细胞类型。
在过去的十年中, 大量的体外3D 模型已经开发, 以重述和调查的体内肿瘤生物学, 微环境和生长条件的癌细胞1,2。二维 (2D) 单层细胞培养系统, 具有均匀暴露于生物化学因素和研究化合物, 不能复制本机3D 的肿瘤-基质相互作用暴露在一个梯度的化合物扩散通过细胞外基质蛋白 (ECM)3,4。因此, 与2D 组织培养模型相比, 3D 癌症模型已经显现出更好的模拟肿瘤微环境的潜能, 并成为更好地了解体内肿瘤特征的重要工具, 如缺氧、纤维组织, 休眠, 药物显, 毒性和治疗抵抗5,6。为此, 3D 模型有潜力通过模仿体内肿瘤的特点来弥合2D 细胞培养和整个动物模型之间的差距, 同时相对便宜和优化的快速生成和一致性。这些优势正在被利用, 以加快在许多领域的转化研究, 包括癌症生物学, 形态发生和组织工程7,8。
在激增的3D 组织培养方法, 磁悬浮技术最近开发和描述的增长, 检测和成像的椭球衍生的各种细胞类型9,10,11,12. 磁性3D 打印利用磁力来设计组织, 用具有生物相容性的纳米粒子磁化细胞, 并以井的格式印刷它们。这使得快速生产一致, 接近相同的3D 椭球, 这可以被利用和使用的大量下游应用生物化学和生物物理调查10。在这里, 我们已经适应了磁性打印技术使用一种生物相容性的材料称为 Nanoshuttle (NS) 组成的氧化铁, 聚 l-赖氨酸和金纳米粒子标记胰腺癌细胞和成纤维细胞。NS 附加静电到等离子膜, 不知道绑定到任何特定的受体, 并释放出细胞表面在一周内。它需要非常低的磁力 (30pN), 足以聚集但不伤害细胞, 不影响细胞活力, 新陈代谢或增殖, 使其极为生物相容的3D 培养10,13,14 ,15。
本研究以胰腺癌为例和模型, 描述了3D 癌细胞-成纤维细胞椭球的生成和代谢测定。从2D 血管培养的细胞开始, 我们用磁性打印说明了胰腺肿瘤-成纤维细胞共培养椭球的生长条件。培养的椭球, 然后使用细胞外通量分析仪的功能代谢分析, 技术表明, 同时测量两个主要的能量产生途径, 糖酵解和线粒体呼吸, 在各种生活细胞和组织16,17,18,19,20。糖酵解被测量作为细胞外酸化率 (ECAR) 的变化, 而线粒体呼吸或氧化磷酸化被测量为耗氧率 (OCR)。我们建议, 该方法开发的胰腺肿瘤椭球可作为一个骨干的优化和翻译3D 肿瘤球体的生成和分析其他细胞/组织类型。
使用胰腺癌, 3rd导致的癌症相关死亡的美国24, 作为一个例子和模型, 建立了快速和一致的方法生长和测定3D 椭球利用胰腺癌细胞培养和活化的胰腺成纤维细胞。利用磁性打印, 从直径400-600 µm 的尺寸中获得了椭球范围。这些被接受了新陈代谢的试验成功地测试了培养的3D 椭球的功能。这种方法简单, 一致, 可以很容易地适应其他细胞类型。
虽然这一方法将加速和增加的转化值的测试执行与3D 椭球, 它可以改进的技术, 允许复用的球体操作和处理。这将进一步减少进行化验所需的总时间、成本和劳力。此外, 还可以使用球体卷来规范 OCR 信号, 如其他人所报告的那样6。按单元格的平均体积归一化的球体体积可用于确定每个单元格的 ocr, 但由于椭球的增长不会完全相同, 因此计算每个单元格的绝对 ocr 可能会有挑战性。目前, 这种方法是有限的, 缺乏一个有效的工具, 多复用球体处理和转移从生长板到化验环境。
所描述的方法是修改和改编自磁性打印技术, 并进一步验证, 以显示功能相关性通过应用培养椭球的下游代谢试验。该方法提供了一个重要的工具, 以产生强大的, 可行的和功能椭球, 其中包含两个主要的细胞类型发现在大多数肿瘤组织, 癌细胞和肿瘤相关的成纤维细胞, 可用于其他研究化验,例如药物屏幕。与其他方法25相比, NS 方法的相对易用性和效率是一个主要的改进, 如挂起方法2、26的椭球生成。
强健的椭球产生的, 因此提供了一个体外肿瘤模型, 其中包括基质细胞, 这往往是从许多3D 文化研究缺少。应用3D 椭球模型的可能性是巨大的。例如, 这种模型可以用来研究细胞间的相互作用, 生物转移和测试的遗传易感性和依赖性的各种治疗方案。3D 椭球, 重述的在体内肿瘤微环境是非常相关和有用的工具的药物筛选研究和那些调查的作用机制的电流和新疗法。代谢分析探索使用椭球培养的突变细胞的能量通路可能有助于揭示这些基因和相关通路在病理的相关3D 癌症模型中的作用, 如本研究中所描述的椭球。
这种方法的成功应用首先依赖于磁性印刷所需的细胞的健康, 这就是为什么在对数相中生长的细胞应该被捕获和磁化。关键是使用磁性球体驱动器打印磁化细胞, 而不是持有驱动器, 这应该只在球体洗涤和媒体补充步骤的描述方法。另一个最关键的方面为成功的读出新陈代谢的分析是保持形态学的椭球在转移过程中从生长板到化验板。
总的来说, 这项协议已经建立了3D 椭球, 既包含癌症和基质细胞, 继随后的代谢检测椭球使用细胞外通量分析仪。该方法的主要特点是: 快速、易适应、前后一致、与体内肿瘤微环境相关并模拟, 比较便宜, 可作为研究肿瘤生物学和发展抗癌的新工具。代理.
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 Samuel Zirbel 协助优化培养条件和球体生长监测。我们非常感谢安捷伦科技提供的海马 XFe96 分析仪、 检测试剂和技术的见解。我们还感谢博士赫曼特科克 Barts 癌症研究所在联合王国提供 PS1 细胞。这项工作支持部分由沧桑 Magowitz 基金会胰腺肿瘤研究和站达癌症癌症研究英国乐园基金会胰癌梦团队研究的资助 (授权编号: SU2C-美国癌症研究学会-DT-20-16)。站起来对癌症是一个娱乐产业基金会的计划。研究经费由美国协会管理用于癌症研究,SU2C 的科学伙伴。
0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
D-Glucose | Sigma | D9434 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4°C |
Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |