Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA
概要
L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale per analizzare le interazioni tra proteine RNA. Tradizionalmente la maggior parte degli esperimenti hanno utilizzato gel verticale. Tuttavia, i gel orizzontali offrono diversi vantaggi, come l'opportunità di monitorare i complessi durante l'elettroforesi. Forniamo un protocollo dettagliato per la generazione e l'uso di elettroforesi geotermica orizzontale.
Abstract
L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale della biologia molecolare che è stato usato ampiamente per l'analisi biochimica delle interazioni di proteine RNA. Queste interazioni sono state tradizionalmente analizzate con gel di poliacrilammide generati tra due lastre di vetro e campioni elettroforati verticalmente. Tuttavia, i gel di poliacrilamide gettati in vassoi e elettroforesi orizzontalmente offre diversi vantaggi. Ad esempio, i gel orizzontali utilizzati per analizzare complessi tra substrati di RNA fluorescenti e proteine specifiche possono essere riprese più volte come l'avanzamento dell'elettroforesi. Questo fornisce l'opportunità unica di monitorare complessi proteina RNA in diversi punti durante l'esperimento. Inoltre, l'elettroforesi orizzontale a gel permette di analizzare molti campioni in parallelo. Ciò può notevolmente facilitare esperimenti di tempo e analizzare più reazioni simultaneamente per confrontare componenti e condizioni differenti. Qui abbiamo prOvide un protocollo dettagliato per la generazione e l'utilizzo di elettroforesi geotermica orizzontale per l'analisi delle interazioni RNA-Protein.
Introduction
I test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSAs) hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso biochimico per analizzare le interazioni specifiche dell'acido nucleico-proteico 1 , 2 , 3 . Questi test possono fornire informazioni importanti riguardo all'affinità di legame delle proteine all'RNA o al DNA 3 , la stechiometria del complesso 1 dei proteine nucleici e fornire importanti novità circa la specificità di legame delle proteine legate all'RNA tramite esperimenti di concorrenza del substrato 1 .
La configurazione sperimentale tradizionale per questi dosaggi consiste nel mescolare la proteina purificata con un substrato RNA radiomarcato. I complessi risultanti vengono poi analizzati con gel di poliacrilammide non denaturanti (nativi) versati tra due lastre di vetro seguite da elettroforesi di campione in un apparecchio verticale 3. Mentre questo approccio è stato utilizzato in modo esaustivo per fornire importanti conoscenze nei meccanismi biochimici che sono alla base del legame delle proteine agli acidi nucleici, ha anche diverse limitazioni. Ad esempio, questa strategia di base ha un rendimento relativamente basso e non è facilmente adattabile per applicazioni che richiedono l'analisi di molte reazioni vincolanti in parallelo. Inoltre, con l'apparato verticale tradizionale è impegnativo monitorare potenzialmente complessi in più volte durante l'elettroforesi 3 , 4 .
Qui presentiamo un adattamento del test EMSA che utilizza gel naturali di poliacrilammide gettate in un apparecchio pianale, elettroforesi orizzontale e sostanze RNA a fluorescenza 4 , 5 , 6 , 7 . L'incorporazione di queste modifiche relativamente semplici alla base straTegy fornisce alcuni potenti vantaggi. In particolare, il formato orizzontale a piattaforma si presta facilmente ad analizzare contemporaneamente dozzine di campioni 4 . Inoltre, per alcuni complessi di proteine RNA, come quelle formate tra la proteina Bicaudal-C e l'elettroforesi del suo substrato RNA in un gel orizzontale, fornisce una maggiore capacità di risolvere complessi distinti di proteine RNA e di discriminarli dal substrato RNA non legato.
Protocol
Representative Results
Discussion
I gel naturali di polyacrylamide sono uno strumento prezioso per indagare le interazioni proteina-RNA e tradizionalmente questi gel sono elettroforizzati verticalmente 2 , 3 . Abbiamo utilizzato una modifica del protocollo che sostituisce gel naturali di poliacrilammide creati ed elettroforesi orizzontalmente 1 , 4 , 6 , 7 ,…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Laura Vanderploeg per la preparazione di figure. Il lavoro nel laboratorio Sheets è supportato dalla sovvenzione NSF 1050395 e dalla concessione di NIH (R21HD076828). Il lavoro nel laboratorio di Ryder è supportato da NIH concede R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle è sostenuta da una Scienza GRS Advanced Opportunity Fellowship attraverso l'Università di Wisconsin-Madison Scuola di Laurea e Programma di Formazione Biotecnologia attraverso l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute (T32GM008349).
Materials
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
参考文献
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