概要

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Published: July 28, 2017
doi:

概要

Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel hulpmiddel voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties. Traditioneel hebben de meeste experimenten verticale gels gebruikt. Horizontale gels verschaffen echter verschillende voordelen, zoals de mogelijkheid om complexen te monitoren tijdens elektroforese. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese.

Abstract

Inheemse polyacrylamide gelelektroforese is een fundamenteel instrument van moleculaire biologie die extensief is gebruikt voor de biochemische analyse van RNA-eiwitinteracties. Deze interacties zijn traditioneel geanalyseerd met polyacrylamidegels die worden gegenereerd tussen twee glazen platen en monsters die verticaal worden geforoteerd. Polyacrylamide gels die in bakken worden gegoten en elektroforeseer horizontaal bieden echter verschillende voordelen. Bijvoorbeeld, horizontale gels die gebruikt worden om complexen te analyseren tussen fluorescerende RNA-substraten en specifieke eiwitten kunnen meerdere malen worden weergegeven als elektroforese vordert. Dit biedt de unieke mogelijkheid om RNA-eiwitcomplexen op verschillende punten tijdens het experiment te volgen. Daarnaast maakt horizontale gelelektroforese het mogelijk om veel monsters parallel te analyseren. Dit kan de tijdcursusproeven aanzienlijk vergemakkelijken en meerdere reacties tegelijk analyseren om verschillende componenten en condities te vergelijken. Hier prOvide een gedetailleerd protocol voor het genereren en gebruiken van horizontale inheemse gelelektroforese voor het analyseren van RNA-eiwitinteracties.

Introduction

Elektroforetische mobiliteitsverschuivingsbepalingen (EMSA's) blijken een waardevol biochemisch instrument te zijn om specifieke eiwit-nucleïnezuurinteracties 1 , 2 , 3 te analyseren. Deze analyses kunnen belangrijke informatie verschaffen over de bindingsaffiniteit van eiwitten aan RNA of DNA 3 , de componentstochiometrie van nucleïnezuur-eiwitcomplexen 1 en verschaffen belangrijke nieuwe inzichten over de bindingsspecificiteit van RNA bindende eiwitten via substraatconcurrentie experimenten 1 .

De traditionele experimentele opstelling voor deze analyses bestaat uit het mengen van gezuiverd eiwit met een radioactief gemerkt RNA-substraat. De resulterende complexen worden vervolgens geanalyseerd met niet-denaturerende (inheemse) polyacrylamidegelen die tussen twee glazen platen worden gegoten, gevolgd door monsterelektroforese in een verticaal apparaat 3. Hoewel deze benadering extensief is gebruikt om belangrijke inzichten te verschaffen in de biochemische mechanismen die de binding van eiwitten tot nucleïnezuren onderbouwen, heeft het ook verschillende beperkingen. Deze basisstrategie heeft bijvoorbeeld een relatief lage doorvoer en het is niet gemakkelijk aan te passen voor toepassingen waarbij parallel bindende reacties nodig zijn. Bovendien is het bij het traditionele verticale apparaat uitdagend om meerdere keren complexen mogelijk te houden tijdens elektroforese 3 , 4 .

Hier presenteren we een aanpassing van de EMSA-analyse die gebruik maakt van inheemse polyacrylamidegels die worden gegoten in een flatbed apparaat, horizontale elektroforese en fluorescent gelabelde RNA substraten 4 , 5 , 6 , 7 . De opneming van deze relatief eenvoudige wijzigingen van de basis straTegy biedt een aantal sterke voordelen. In het bijzonder leent het horizontale platform formaat zich gemakkelijk om tientallen monsters tegelijkertijd 4 te analyseren. Ook voor sommige RNA-eiwitcomplexen, zoals die gevormd tussen het Bicaudal-C-eiwit en zijn RNA-substraatelektroforese in een horizontale gel, verschaft een verhoogd vermogen om afzonderlijke RNA-eiwitcomplexen op te lossen en deze te onderscheiden van het niet-gebonden RNA-substraat.

Protocol

1. Bereiding van de Horizontale Native Polyacrylamide Gel 4 . Voorbereiding van de benodigde materialen. Voor het horizontale gelapparaat gebruik een gelendoos (37 cm x 24 cm) met een 27 cm x 21 cm lade en een capaciteit voor twee combinaties met 24 putjes. Deze installatie biedt in totaal 48 monsters die tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd. Bereid de volgende reagentia voor: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED en …

Representative Results

Om de kracht en de veelzijdigheid van de horizontale inheemse gelelektroforese te demonstreren hebben we de binding van het Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) eiwit geanalyseerd aan een fluorescent gemerkt RNA dat een Bicc1 bindingsplaats bevat. Bicc1-eiwitten functioneren als mRNA-specifieke translatie-repressors om de beslissingen van het celfeest tijdens de moederstadia van dierlijke ontwikkeling 9 , 10 , <sup clas…

Discussion

Inheemse polyacrylamidegelen zijn een waardevol hulpmiddel om eiwit-RNA-interacties te onderzoeken en traditioneel worden deze gels verticaal 2 , 3 elektroforeseert. Wij hebben een wijziging van het protocol gebruikt dat de inheemse polyacrylamide gels creëert en horizontaal 1 , 4 , 6 , 7 , 15 elektr…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Laura Vanderploeg voor het voorbereiden van cijfers. Werk in het laboratorium Sheets wordt ondersteund door NSF grant 1050395 en NIH grant (R21HD076828). Werk in het Ryder lab wordt ondersteund door NIH subsidies R01GM117237 en R01GM117008. Megan Dowdle wordt ondersteund door een SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship door het University of Wisconsin-Madison Graduate School en Biotechnology Training Programma door het Nationaal Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health (T32GM008349).

Materials

Horizontal Gel Box OWL N/A Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP
24-well large large horizontal gel electrophoresis combs OWL N/A Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C
Powerpac 300 Bio-Rad 1655050
Mini-Protean II Electrophoresis Cell Bio-Rad 165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis IBI IB70015
TEMED IBI IB70120
APS IBI IB70080
Yeast tRNAs Ambion AM7119
Fluorescein labeled RNA IDT N/A Order can be made custom to length and desired sequence
EDTA tetrasodium salt hydrate Sigma-Aldrich E5391-1KG
HEPES Sigma-Aldrich H4034-500G
Tris Base Ultrapure US Biological T8600
Boric Acid Fisher Scientific BP168-500
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
DEPC Sigma-Aldrich 1609-47-8
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 3483 12 3
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8

参考文献

  1. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  2. Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
  5. Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
  6. Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
  7. Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
  8. Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
  9. Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
  10. Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  11. Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  12. Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  13. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  14. Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  15. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
  16. Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).

Play Video

記事を引用
Dowdle, M. E., Imboden, S. B., Park, S., Ryder, S. P., Sheets, M. D. Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes. J. Vis. Exp. (125), e56031, doi:10.3791/56031 (2017).

View Video