JoVE Journal > Biochemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生化学

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Published: July 28, 2017
doi:
10.3791/56011
, , ,
1生物学科,KU Leuven

概要

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Abstract

RNA bağlayıcı proteinler (RBPler) RNA'ların kaderini belirler. Bütün RNA biyogenez yollarına katılırlar ve özellikle haberci RNA'ların (mRNA'lar) post-transkripsiyonel gen regülasyonuna (PTGR) katkıda bulunurlar. Son birkaç yılda, maya ve memeli hücresi soylarından elde edilen bir dizi mRNA'ya bağlı proteom, "mRNA etkileşimli yakalama" adı verilen ve mRNA'ya bağlanan proteinlerin (mRBP'lerin) tanımlanmasına izin veren yeni bir yöntem kullanılarak başarıyla izole edilmiştir. Doğrudan bir fizyolojik ortamdan. Yöntem in vivo ultraviyole (UV) çapraz bağlama, oligon (dT) boncuklar ile haberci ribonükleoprotein komplekslerinin (mRNPs) aşağı çekilmesi ve saflaştırılması ve ardından kütle spektrometresi (MS) ile çapraz bağlanmış proteinlerin tanımlanmasından oluşur. Çok yakın bir tarihte, aynı yöntemi uygulayarak, çeşitli Arabidopsis doku kaynaklarına eşzamanlı olarak birkaç bitki mRNA'ya bağlı proteom rapor edilmiştir: etiyole edilmiş fideler, yaprak dokusu,Yaprak mezofil protoplastları ve kültür kökü hücreleri. Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları için optimize edilmiş mRNA etkileşimli yakalama yöntemini sunuyoruz. Bu hücre türü, çeşitli hücresel tahliller içeren deneyler için çok yönlü bir araç olarak hizmet etmektedir. Optimum protein verimi için koşullar, başlangıç ​​dokusu miktarını ve UV ışınlama süresini içerir. Orta ölçekli bir deneyden (10 7 hücre) elde edilen mRNA'ya bağlı proteomda, RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu kaydedilen RBP'lerin aşırı temsil edildiği bulundu ve birçok yeni RBP tespit edildi. Deney ölçeklenebilir (10 9 hücre) ve optimize yöntem, bitkilerdeki mRNA bağlı proteomları geniş ölçüde izole etmek, kataloglamak ve karşılaştırmak için diğer bitki hücre tiplerine ve türüne uygulanabilir.

Introduction

Ökaryotlar, hücresel biyolojik süreçleri korumak için çoklu RNA biyogenez düzenleyici yollarını kullanır. Bilinen RNA türleri arasında mRNA çok çeşitlidir ve proteinlerin ve izoformlarının kodlama kapasitesini taşır 1. PTGR yolu, pre-mRNA'ların 2 , 3'ün kaderini yönlendirir. Farklı gen ailelerinden RBP'ler RNA regülasyonunu kontrol eder ve PTGR'da spesifik mRBPler mRNA'ları doğrudan fiziksel etkileşimler yoluyla yönlendirerek fonksiyonel mRNA'ları oluştururlar. Bu nedenle, tanımlanması ve mRBPs karakterize ve mRNPs son üç yıl .Over hücresel mRNA metabolizması 2 düzenleme anlamak için kritiktir, çeşitli in vitro yöntemler – RNA elektroforetik mobilite kayma (Remsa) analizleri, üstel zenginleştirme deneyleri ile ligandların sistematik evrimi dahil olmak üzere (SELEX), kütüphane türevli yapılara, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radyoaktif işaretlenmiş veya nicelikselFloresan RNA bağlama deneyleri, X-ışını kristalografisi ve NMR spektroskopisi 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 – esas olarak memeli hücrelerinden RBP çalışmalarına uygulanmıştır. Bu memeli RBP çalışmalarının sonuçları, yayınlanmış gözlemleri toplayan RNA-bağlayıcı Protein Veri Tabanı (RBPDB) vasıtasıyla aranabilir ( 10) .

Bu in vitro yaklaşımlar güçlü araçlar olmasına rağmen, belirli bir RNA dizisi havuzundan bağlı RNA motiflerini belirler ve bu nedenle yeni hedef RNA'ları keşfetme yetenekleri sınırlıdır. Aynı şey, protein dizisinin ve yapısının 15 korunmasına dayanan genom çapında RBP'leri öngörmek için hesaplama stratejileri için de geçerlidir. Bunun üstesinden gelmek için, yeni bir deneysel yöntem haBir RBP'nin etkileşime girdiği RNA motiflerinin tanımlanmasına ve bağlanmanın tam yerinin belirlenmesine izin veren bir dizi kurulmuştur. "Çapraz bağlama ve immüno çökeltme" (CLIP) adı verilen bu yöntem, in vivo UV çapraz bağlanma ve ardından immüno çökeltme 11'den oluşur . Erken yapılan çalışmalar, DNA ve RNA nükleotidlerinin fotoaktifleşmesinin, 245 nm'den daha yüksek uyaran UV dalga boylarında oluşabileceğini göstermiştir. 12: timidin ile reaksiyonu (dT ≥ dC> rU> Re, dA, dG azalma photoreactivity sırasına göre sıralama) tercih görünüyor. 254 nm dalga boyunda (UV-C) UV ışığı kullanarak RNA nükleotidleri ve protein kalıntıları arasındaki kovalent bağların sadece birkaç Angstrom (Å) aralığında oluştuğu gözlemlendi. Dolayısıyla fenomen, RNA ve RBP'nin "sıfır uzunluklu" çapraz bağlanması olarak adlandırılır. Bunu takiben katı bir arındırma işlemi izlenebilir Az arka planla dür 13 , 14 .

CLIP'i tamamlayan bir strateji, RBP'lerin manzarasını tanımlamak için protein tanımlaması ile in vivo UV çapraz bağlamayı birleştirmektir. "MRNA etkileşimli yakalama" adı verilen bu yeni deneysel yaklaşımı kullanarak maya hücrelerinden, embriyonik kök hücrelerden (ESC'ler) ve insan hücre çizgilerinden ( örn., HEK293 ve HeLa) izole edilmiş bu tür genom çapında mRNA'ya bağlı proteomlar 18 , 19 , 20 , 21 . Yöntem in vivo UV çapraz bağlanma, ardından mRNP saflaştırması ve MS tabanlı proteomiklerden oluşur. Bu stratejiyi uygulayarak, kanonik olmayan RBD'ler içeren birçok yeni "ay ışığı alan" RBP keşfedildi ve daha fazla proteininin önceden tahmin edildiğinden daha fazla RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu netleşti."> 15 , 16 , 17. Bu yöntemin kullanılması yeni başvurulara ve RBP'leri araştırırken yeni biyolojik soruları cevaplama yeteneğine izin verir Örneğin son zamanlarda yapılan bir araştırma mRNA'ya bağlı proteomun (ana RBP) korunmasını araştırmıştır Proteom) maya ve insan hücreleri arasında 22 .

Bitki RBP'leri, büyümede ve gelişmede ( örneğin , çiçeklenme zamanının transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde, sirkadyere ait saatte ve mitokondriyum ve kloroplastlarda gen ifadesi gibi) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Dahası, abiyotik streslere ( örn. Soğuk, kuraklık, sönümlenme) yanıt veren hücresel süreçlerde işlevleri yerine getirdiği düşünülmektedirLinity ve absisik asit (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34'tür . Arabidopsis thaliana genomunda RNA tanıma motifi (RRM) ve K homoloji (KH) alan dizisi motiflerine dayanan 200'den fazla tahmini RBP geni vardır; Pirinçte yaklaşık 250, 35 , 36 olarak kaydedildi. Birçok tahmin RBPS birçok yeni fonksiyonlara hizmet verdiği düşündüren 35 (RRM alanını içeren tahmin Arabidopsis RBPS yaklaşık% 50'ye örneğin hiçbir metazoan ortologlarıyla) bitkilere özgü olduğu söylenemez dikkat çekicidir. Tahmini RBP'lerin çoğu işlevleri tanımlanmamış halde kalır 23 .

Arabidopsis etiylü fidelerden, yaprak dokusundan, kültür kök hücrelerinden ve yaprak mezofil protoplastlarından mRNA'ya bağlı proteomların izolasyonu,mRNA interaktom yakalama geçenlerde, 39 38 bildirilmiştir. Bu çalışmalar, yakın gelecekte bitkilerde fonksiyonel RBP'lerin sistematik olarak kataloglanmasının güçlü potansiyelini ortaya koymaktadır. Burada, bitki protoplastlarından ( yani, hücre duvarları olmayan hücrelerden) mRNA interaksiyonu yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları, en önemli yaprak hücresi türüdür. İzole edilmiş protoplastlar, UV ışığının hücrelere en iyi şekilde erişilmesine izin verir. Bu hücre tipi, fonksiyonel karakterizasyon için proteinleri geçici olarak ifade eden tahlillerde kullanılabilir 40 , 41 . Ayrıca protoplast, birkaç diğer bitki hücre türüne ve tür 42 , 43 , 44'e uygulanmıştır ( örneğin, Petersson ve diğerleri , 2009; Bargmann ve Birnbaum, 2010; ve Hong ve ark ., 2012).

<P class = "jove_content"> Yöntem toplam 11 basamağı kapsamaktadır ( Şekil 1A ). Arabidopsis yaprak mezofil protoplastları önce izole edilir (aşama 1) ve sonra çapraz bağlanmış mRNP'leri oluşturmak için UV ışınlarına maruz bırakılır (aşama 2). Protoplastlar denatüre edici şartlar altında parçalandığında (basamak 3), çapraz bağlanmış mRNPler liziz / bağlama tamponunda serbest bırakılır ve oligo-d (T) 25 boncuklar tarafından çekilir (adım 4). Sıkı yıkamalar birkaç tur sonra, mRNPs saflaştırılmış ve daha da analiz edilir. MRBP'lerin denatüre peptitleri, çapraz bağlı mRNA'lar saflaştırılmadan ve RNA kalitesi qRT-PCR ile doğrulanmadan önce proteinaz K ile sindirilir (adımlar 5 ve 6). RNaz işlemi ve protein konsantrasyonundan (7. adım) sonra, protein kalitesi SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve gümüş boyama (adım 8) ile kontrol edilir. Protein band örüntülerindeki fark, çapraz bağlı bir numune (CL) ile çapraz bağlanmamış bir numune (CL olmayan;UV ışınlamasına tabi tutulmayan protoplastlardan gelen negatif kontrol örneği). Proteinlerin tanımlanması, MS tabanlı proteomikler aracılığıyla gerçekleştirilir. CL örneğinden gelen proteinler olası arka plan kontaminasyonunu gidermek için tek boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi (1D-PAGE) ile ayrılır, tripsin kullanılarak kısa peptidlere "in-jel ile sindirilir" ve saflaştırılır (adım 9). Nano ters faz sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisine (nano-LC-MS) bağlı olarak, mRNA'ya bağlı proteomdaki kesin protein miktarının belirlenmesine olanak tanır (basamak 10). Son olarak tanımlanan mRNA'lar, biyoenformatik analiz (adım 11) kullanılarak karakterize edilir ve kataloglanır.

Protocol

1. Arabidopsis Yaprak Mezofil Protoplast İzolasyonu NOT: Arabidopsis yaprak mezofil protoplastları, Yoo ve diğerleri , 2007 tarafından çeşitli dönüşümleri 40 ile tarif edildiği gibi temel olarak izole edilir. Bitkilerde büyüme Tabakalaşma için yaklaşık 200 Arabidopsis thaliana Col-0 ekotip tohumlarını sterilize edilmiş suda 4 ° C'de karanlıkta 2 gün süreyle bekletin. <…

Representative Results

CL örneğinde boncuk taneciklerini çevreleyen, yıkama basamağı 4.3'de yıkama tamponu 2 ile ( Şekil 1B ) karakteristik bir halo gözlemledik. Araştırılmamış olmasına rağmen, bu fenomen manyetik yakalama esnasında boncuk agregasyonu ile çapraz bağlanmış mRNP komplekslerinin etkileşimi ile muhtemelen açıklanabilir ve daha yaygın bir agreganın oluşmasına neden olur. Oligo-d (T) 25 boncuk yakalama etkisinin <sup class="xre…

Discussion

Mayalar ve insan hücreleri için geliştirilmiş mRNA etkileşim yakalamasını yaprak mezofil protoplastlarına başarılı bir şekilde uyguladık. Yaprak yapraklarındaki başlıca zımpara türü mezofil hücreleridir. Bu yöntemin en büyük avantajı, fizyolojik bir ortamdan proteinleri keşfetmek için in vivo çapraz bağlamayı kullanmasıdır.

Bu protokolde, esas olarak birtakım optimize edilmiş deneysel koşulları ( örn., Başlangıç ​​materyali olarak …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Geleneksel UV lamba ile donatılmış UV çapraz bağlama cihazını sağlayan Prof. Joris Winderickx'in laboratuvarını kabul ediyoruz. KG, KU Leuven araştırma fonu tarafından desteklenmekte ve FWO hibe G065713N'den destek aldığını onaylamaktadır.

Materials

REAGENTS
0.8 M Mannitol Sigma M1902-500G Primary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2M KCl MERCK Art. 4935 Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)		 Sigma-aldrich M2933 Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g		 Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. MACEROZYME R-10, 10g Final isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)		 Sigma-aldrich A7906-100G Final isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1M CaCl2 Chem-Lab NV CL00.0317.1000 Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1M NaCl Fisher Chemical S/3160/60 W5 buffer
2M MgCl2 Sigma M8266-100G MMg solution
1M LiCl
(Lithium Chloride)		 Acros 199885000 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)		 Sigma-aldrich L4632-25G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1M DTT
(Dithiothreitol)		 Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2		 307866 Lysis/binding buffer,
1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) Acros &
Fisher Chemical		 167620010 &
H/1200/PB15		 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-aldrich ED-500G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20 MERCK 8.22184.0500 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOH VWR PROLABO CHEMICALS 28244.295 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1X PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)		 Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		 S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL) Thermo Fisher Scientific 11789020 Protein digestion
Loading dye Invitrogen LC5925 SDS-PAGE
qPCR master mix Promega A6001 qRT-PCR assay
RNase Cocktail Thermo Fisher Scientific AM2286 RNA digestion
Methanol Sigma-aldrich 322415 Gel fixation and gel destaining
Acetic acid Sigma-aldrich 537020 Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Fisher Scientific 20278 Gel staining
1M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 		 Sigma-aldrich 09830-500G Gel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)		 Sigma-aldrich 34851-100ML Gel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)		 Sigma-aldrich I4386-10G Alkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)		 Sigma-aldrich 302031-10X1ML Peptide dissolving solution
FA
(Formic acid)		 Sigma-aldrich 06554-5G Peptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL) Promega V5280 Digestion buffer
Name Company Catalog Number コメント
EQUIPMENT
Soil Peltracom LP2D Plant growth
Vermiculite 3 Sibli AS 05VERMICULIET Plant growth
Petri dish (150 x 20 mm) Sarstedt 82.1184.500 Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filter Millipore SE2M229104 Homogenization of final isotonic enzyme solution
Razorblade Agar Scientific T585 Rosette leaf strips
35-75 μm nylon mesh SEFAR NITEX 74010 Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubes Sigma-aldrich T1918-10EA Carrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)		 MARIENFELD 650030 Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(HL-2000 HybriLinker)		 UVP, LLC UVP95003101 in vivo UV crosslinking
UV lamp
(Sankyo-Denki G8T5)		 SANKYO
DENKI		 SD G8T5 in vivo UV crosslinking
50 mL glass syringe FORTUNA Optima Z314560 Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm) Becton Dickinson microlance 3 2021-04 Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26 Labinco BV 26110912 Sample incubation by rotating
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)		 New England BioLabs S1419S mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Magnetic rack Invitrogen CS15000 mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Centrifugal filter units
(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)		 EMD Millipore UFC800308 mRBP concentration
Pierce Silver Stain Kit Thermo Fisher Scientific 24612 Silver-staining assay
RNA purification kit
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		 STRATEC Molecular 1064100300 RNA purification
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific ND-1000 RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)		 Thermo Fisher Scientific 4376600 cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ-C18 columns)		 Sigma-aldrich 720046-960EA Peptide purification
Mass spectrometer
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)		 Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR Mass spectrometry-based proteomics
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO Mass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)		 Thermo Fisher Scientific ES800 Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)		 Thermo Fisher Scientific 160321 Mass spectrometry-based proteomics
Name Company Catalog Number コメント
Primers for qRT-PCR assay Sequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		 Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		 Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 533-544 (2015).
  2. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  3. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nat Rev Genet. 15 (12), 829-845 (2014).
  4. Lin, Q., Taylor, S. J., Shalloway, D. Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains. J Biol Chem. 272 (43), 27274-27280 (1997).
  5. Deo, R. C., Bonanno, J. B., Sonenberg, N., Burley, S. K. Recognition of polyadenylate RNA by the poly(A)-binding protein. Cell. 98 (6), 835-845 (1999).
  6. Kattapuram, T., Yang, S., Maki, J. L., Stone, J. R. Protein kinase CK1 alpha regulates mRNA binding by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein c in response to physiologic levels of hydrogen peroxide. J Biol Chem. 280 (15), 15340-15347 (2005).
  7. Patel, G. P., Ma, S., Bag, J. The autoregulatory translational control element of poly(A)-binding protein mRNA forms a heteromeric ribonucleoprotein complex. Nucleic Acids Res. 33 (22), 7074-7089 (2005).
  8. Song, J. K., McGivern, J. V., Nichols, K. W., Markley, J. L., Sheets, M. D. Structural basis for RNA recognition by a type II poly(A)-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (40), 15317-15322 (2008).
  9. Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Mol Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
  10. Cook, K. B., Kazan, H., Zuberi, K., Morris, Q., Hughes, T. R. RBPDB: a database of RNA-binding specificities. Nucleic Acids Res. 39, D301-D308 (2011).
  11. Konig, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13 (2), 77-83 (2012).
  12. Hockensmith, J. W., Kubasek, W. L., Vorachek, W. R., von Hippel, P. H. Laser cross-linking of nucleic acids to proteins. Methodology and first applications to the phage T4 DNA replication system. J Biol Chem. 261 (8), 3512-3518 (1986).
  13. Pashev, I. G., Dimitrov, S. I., Angelov, D. Crosslinking proteins to nucleic acids by ultraviolet laser irradiation. Trends Biochem Sci. 16 (9), 323-326 (1991).
  14. Castello, A., et al. System-wide identification of RNA-binding proteins by interactome capture. Nat Protoc. 8 (3), 491-500 (2013).
  15. Nagy, E., Rigby, W. F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase selectively binds AU-rich RNA in the NAD(+)-binding region (Rossmann fold). J Biol Chem. 270 (6), 2755-2763 (1995).
  16. Hentze, M. W., Preiss, T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci. 35 (8), 423-426 (2010).
  17. Nicholls, C., Li, H., Liu, J. P. GAPDH: a common enzyme with uncommon functions. Clin Exp Pharmacol Physiol. 39 (8), 674-679 (2012).
  18. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  19. Castello, A., et al. Insights into RNA Biology from an Atlas of Mammalian mRNA-Binding Proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  20. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  21. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 127-133 (2013).
  22. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6 (10127), 1-9 (2015).
  23. Bailey-Serres, J., Sorenson, R., Juntawong, P. Getting the message across: cytoplasmic ribonucleoprotein complexes. Trends Plant Sci. 14 (8), 443-453 (2009).
  24. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22 (12), 3142-3152 (2003).
  25. Lim, M. H., et al. A new Arabidopsis gene, FLK, encodes an RNA binding protein with K homology motifs and regulates flowering time via FLOWERING LOCUS C. Plant Cell. 16 (3), 731-740 (2004).
  26. Hornyik, C., Terzi, L. C., Simpson, G. G. The spen family protein FPA controls alternative cleavage and polyadenylation of RNA. Dev Cell. 18 (2), 203-213 (2010).
  27. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annu Rev Plant Biol. 61, 125-155 (2010).
  28. Schmal, C., Reimann, P., Staiger, D. A circadian clock-regulated toggle switch explains AtGRP7 and AtGRP8 oscillations in Arabidopsis thaliana. PLoS Comput Biol. 9 (3), e1002986 (2013).
  29. Staiger, D. RNA-binding proteins and circadian rhythms in Arabidopsis thaliana. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356 (1415), 1755-1759 (2001).
  30. Fischer, B., et al. NovoHMM: a hidden Markov model for de novo peptide sequencing. Anal Chem. 77 (22), 7265-7273 (2005).
  31. Kwak, K. J., Kim, Y. O., Kang, H. Characterization of transgenic Arabidopsis plants overexpressing GR-RBP4 under high salinity, dehydration, or cold stress. J Exp Bot. 56 (421), 3007-3016 (2005).
  32. Raab, S., Toth, Z., de Groot, C., Stamminger, T., Hoth, S. ABA-responsive RNA-binding proteins are involved in chloroplast and stromule function in Arabidopsis seedlings. Planta. 224 (4), 900-914 (2006).
  33. Liu, H. H., et al. Molecular cloning and characterization of a salinity stress-induced gene encoding DEAD-box helicase from the halophyte Apocynum venetum. J Exp Bot. 59 (3), 633-644 (2008).
  34. Wang, S. C., Liang, D., Shi, S. G., Ma, F. W., Shu, H. R., Wang, R. C. Isolation and Characterization of a Novel Drought Responsive Gene Encoding a Glycine-rich RNA-binding Protein in Malus prunifolia (Willd.) Borkh. Plant Mol Biol Report. 29 (1), 125-134 (2011).
  35. Lorkovic, Z. J., Barta, A. Genome analysis: RNA recognition motif (RRM) and K homology (KH) domain RNA-binding proteins from the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 30 (3), 623-635 (2002).
  36. Ambrosone, A., Costa, A., Leone, A., Grillo, S. Beyond transcription: RNA-binding proteins as emerging regulators of plant response to environmental constraints. Plant Science. 182, 12-18 (2012).
  37. Frank, A., Pevzner, P. PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal Chem. 77 (4), 964-973 (2005).
  38. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Sci Rep. 6 (29766), 1-13 (2016).
  39. Reichel, M., et al. In Planta Determination of the mRNA-Binding Proteome of Arabidopsis Etiolated Seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  40. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  41. Niu, Y., Sheen, J. Transient expression assays for quantifying signaling output. Methods Mol Biol. 876, 195-206 (2012).
  42. Petersson, S. V., et al. An auxin gradient and maximum in the Arabidopsis root apex shown by high-resolution cell-specific analysis of IAA distribution and synthesis. Plant Cell. 21 (6), 1659-1668 (2009).
  43. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. J Vis Exp. (36), (2010).
  44. Hong, S. Y., Seo, P. J., Cho, S. H., Park, C. M. Preparation of Leaf Mesophyll Protoplasts for Transient Gene Expression in Brachypodium distachyon. J Plant Biol. 55 (5), 390-397 (2012).
  45. Li, Y., Van den Ende, W., Rolland, F. Sucrose Induction of Anthocyanin Biosynthesis Is Mediated by DELLA. Mol Plant. 7 (3), 570-572 (2014).
  46. Durut, N., et al. A duplicated NUCLEOLIN gene with antagonistic activity is required for chromatin organization of silent 45S rDNA in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (3), 1330-1344 (2014).
  47. Han, Y. H., Ma, B., Zhang, K. Z. SPIDER: Software for protein identification from sequence tags with De Novo sequencing error. J Bioinform Comput Biol. 3 (3), 697-716 (2005).
  48. Han, X., He, L., Xin, L., Shan, B., Ma, B. PeaksPTM: Mass spectrometry-based identification of peptides with unspecified modifications. J Proteome Res. 10 (7), 2930-2936 (2011).
  49. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics. 11 (4), 010587 (2012).
  50. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12 (42), 1-12 (2016).
  51. Zhang, Y., et al. Integrative genome-wide analysis reveals HLP1, a novel RNA-binding protein, regulates plant flowering by targeting alternative polyadenylation. CellRes. 25 (7), 864-876 (2015).
  52. Steen, H., Jensen, O. N. Analysis of protein-nucleic acid interactions by photochemical cross-linking and mass spectrometry. Mass Spec Rev. 21 (3), 163-182 (2002).
  53. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol Syst Biol. 7 (458), 1-13 (2011).
  54. Eng, J., McCormack, A. L., Yates, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. J Am Soc Mass Spectrom. 5 (11), 976-989 (1994).
  55. Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).

タグ

MRNA InteractomeMRNA-bound ProteomePlant ProtoplastsPost-transcriptional Gene RegulationUV CrosslinkingArabidopsis ThalianaLeaf Mesophyll ProtoplastsMMG SolutionCentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Zhang, Z., Boonen, K., Li, M., Geuten, K. mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts. J. Vis. Exp. (125), e56011, doi:10.3791/56011 (2017).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image