MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Eukaryonten verwenden mehrere RNA-Biogenese-regulatorischen Wege, um zelluläre biologische Prozesse aufrechtzuerhalten. Unter den bekannten Arten von RNA ist mRNA sehr vielfältig und trägt die Codierungskapazität von Proteinen und deren Isoformen ^1. Der PTGR-Weg leitet das Schicksal der prä-mRNAs ^{2 , 3} . RBPs von verschiedenen Genfamilien kontrollieren die Regulation von RNA und in PTGR führen spezifische mRBPs mRNAs durch direkte physikalische Wechselwirkungen, die funktionelle mRNPs bilden. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung von mRBPs und deren mRNPs entscheidend für das Verständnis der Regulation des zellulären mRNA-Metabolismus ^2. In den vergangenen drei Jahrzehnten wurden verschiedene in vitro- Methoden – einschließlich RNA-Elektrophorese-Mobilitätsverschiebungen (REMSA) -Anays, systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherungsassays durchgeführt (SELEX) auf Basis von bibliotheksbezogenen Konstrukten, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radioaktiv markiert oder quantitativFluoreszenz-RNA-Bindungsassays, Röntgenkristallographie und NMR-Spektroskopie ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} – wurden weitgehend auf Studien von RBPs, hauptsächlich aus Säugetierzellen, angewendet. Die Ergebnisse dieser Studien von Säugetier RBPs kann über das RNA-bindende Protein DataBase (RBPDB) gesucht werden, die die veröffentlichten Beobachtungen ¹⁰ sammelt.

Obwohl diese in vitro- Ansätze mächtige Werkzeuge sind, bestimmen sie die gebundenen RNA-Motive aus einem gegebenen RNA-Pool von Sequenzen und sind daher in ihrer Fähigkeit, neue Ziel-RNAs zu entdecken, begrenzt. Dasselbe gilt für die Rechenstrategien genomweite RBPs vorherzusagen, die zur Erhaltung der Proteinsequenz basieren und ¹⁵ strukturieren. Um dies zu überwinden, ist eine neue experimentelle Methode haS etabliert, die die Identifizierung der RNA-Motive ermöglicht, mit denen ein RBP von Interesse interagiert, sowie für die Bestimmung der genauen Lage der Bindung. Diese Methode, genannt "Vernetzung und Immunopräzipitation" (CLIP), besteht aus in vivo UV-Vernetzung, gefolgt von Immunopräzipitation ¹¹ . Frühere Studien haben gezeigt, dass die Photoaktivierung von DNA- und RNA-Nukleotiden bei Anregungs-UV-Wellenlängen größer als 245 nm auftreten kann. Die Reaktion durch Thymidin scheint begünstigt zu sein (Rang in der Reihenfolge der verminderten Photoreaktivität: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) ¹² . Unter Verwendung von UV-Licht mit einer Wellenlänge von 254 nm (UV-C) wurde beobachtet, dass kovalente Bindungen zwischen RNA-Nukleotiden und Proteinresten entstehen, wenn sie im Bereich von nur wenigen Angström (Å) liegen. Das Phänomen wird daher als "Null-Länge" Vernetzung von RNA und RBP bezeichnet. Darauf folgt eine strenge Aufreinigung Dure mit wenig Hintergrund ^{13 , 14} .

Eine für CLIP komplementäre Strategie besteht darin, in vivo UV-Vernetzung mit Proteinidentifikation zu kombinieren, um die Landschaft von RBPs zu beschreiben. Eine Reihe solcher genomweite mRNA-gebundenen Proteome wurden aus Hefezellen, embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) und menschlichen Zelllinien (dh, HEK293 und HeLa) unter Verwendung dieses neuen experimentellen Ansatz, genannt „mRNA Interaktom capture“ ^18, isoliert ^{19 , 20 , 21} . Das Verfahren besteht aus in vivo UV-Vernetzung, gefolgt von mRNP-Reinigung und MS-basierter Proteomik. Durch die Anwendung dieser Strategie wurden viele neuartige "Mondlicht" -RBPs, die nicht-kanonische RBDs enthalten, entdeckt worden, und es ist klar geworden, dass mehr Proteine ​​RNA-bindende Kapazitäten haben, als zuvor angenommen"> 15 ^{, 16 , 17.} Die Verwendung dieser Methode ermöglicht neue Anwendungen und die Möglichkeit, bei der Untersuchung von RBPs neue biologische Fragen zu beantworten. So hat beispielsweise eine aktuelle Studie die Konservierung des mRNA-gebundenen Proteoms (der Kern-RBP) untersucht Proteom) zwischen Hefe und menschlichen Zellen ²² .

Pflanze RBPs haben sich bereits in Wachstum und Entwicklung ( z . B. in der posttranskriptionalen Regulation der Blütezeit, der zirkadianen Uhr und der Genexpression in Mitochondrien und Chloroplasten) ^{24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 beteiligt} . Darüber hinaus wird angenommen, dass sie Funktionen in den zellularen Prozessen ausführen, die auf abiotische Belastungen reagieren ( zB Kälte, Dürre, SaLinität und Abszisäure (ABA)) ^{31 , 32 , 33 , 34} . Es gibt mehr als 200 vorhergesagte RBP-Gene im Arabidopsis-Thaliana- Genom, basierend auf RNA-Erkennungsmotiv (RRM) und K-Homologie (KH) Domänensequenzmotiven; In Reis wurden etwa 250 bekannt, ^{35 , 36} . Es ist bemerkenswert, dass viele vorhergesagte RBPs für Pflanzen einzigartig zu sein scheinen ( z. B. keine Metazoan-Orthologe zu etwa 50% der vorhergesagten Arabidopsis- RBPs, die eine RRM-Domäne enthalten) ³⁵ , was darauf hindeutet, dass viele neue Funktionen erfüllen können. Die Funktionen der meisten vorhergesagten RBPs bleiben uncharakterisiert ²³ .

Die Isolierung von mRNA-gebundenen Proteomen aus Arabidopsis etiolierten Sämlinge, Blattgewebe, kultivierte Wurzelzellen und Blatt-Mesophyll-Protoplasten durch den Einsatz vonMRNA-Interaktom-Capture wurde vor kurzem berichtet ^{38 , 39} . Diese Studien zeigen das starke Potenzial der systematischen Katalogisierung von funktionalen RBPs in Anlagen in naher Zukunft. Hier stellen wir ein Protokoll für die mRNA-Interaktom-Erfassung von Pflanzenprotoplasten ( dh Zellen ohne Zellwände) vor. Arabidopsis Thaliana Blatt Mesophyll Protoplasten sind die wichtigsten Arten von Blatt Zelle. Die isolierten Protoplasten ermöglichen einen optimalen Zugang von UV-Licht zu den Zellen. Dieser Zelltyp kann in Assays verwendet werden, die vorübergehend Proteine ​​für die funktionelle Charakterisierung ^{40 , 41} exprimieren. Weiterhin wurde das Protoplasten auf mehrere andere Pflanzenzelltypen und Arten ^{42 , 43 , 44} angewendet ( z. B. Petersson et al ., 2009, Bargmann und Birnbaum, 2010 und Hong et al ., 2012).

<P class = "jove_content"> Die Methode umfasst insgesamt 11 Schritte ( Abbildung 1A ). Arabidopsis- Blatt-Mesophyll-Protoplasten werden zuerst isoliert (Schritt 1) ​​und werden anschließend UV-bestrahlt, um vernetzte mRNPs zu bilden (Schritt 2). Wenn die Protoplasten unter denaturierenden Bedingungen lysiert werden (Schritt 3), werden die vernetzten mRNPs in Lyse / Bindungspuffer freigesetzt und durch Oligo-d (T) _25- Kügelchen (Schritt 4) heruntergezogen. Nach mehreren Runden von stringenten Waschungen werden die mRNPs gereinigt und weiter analysiert. Die denaturierten Peptide von mRBPs werden durch Proteinase K verdaut, bevor die vernetzten mRNAs gereinigt werden und die RNA-Qualität durch qRT-PCR (Schritte 5 und 6) verifiziert wird. Nach der RNase-Behandlung und der Proteinkonzentration (Schritt 7) wird die Proteinqualität durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und Silberfärbung gesteuert (Schritt 8). Der Unterschied in Proteinbandmustern kann leicht zwischen einer vernetzten Probe (CL) und einer nicht vernetzten Probe (nicht-CL;Die Negativkontrollprobe aus Protoplasten, die keiner UV-Bestrahlung ausgesetzt ist). Die Identifizierung von Proteinen wird durch MS-basierte Proteomik erreicht. Die Proteine ​​aus der CL-Probe werden durch eine eindimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (1D-PAGE) getrennt, um mögliche Hintergrundverunreinigungen zu entfernen, werden unter Verwendung von Trypsin "in-Gel-verdaut" in kurze Peptide und werden gereinigt (Schritt 9). Nano-Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt an Massenspektrometrie (Nano-LC-MS) ermöglicht die Bestimmung der Menge an definitiven Proteinen im mRNA-gebundenen Proteom (Schritt 10). Schließlich werden die identifizierten mRBPs unter Verwendung einer bioinformatischen Analyse charakterisiert und katalogisiert (Schritt 11).