Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama
概要
Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Otolog hücre tabanlı terapiler gerçeklik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler getirilmesi ile bir adım daha var. Cenin kök hücre, amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre, gibi farklılaşmamış hücreleri söz doku Mühendisliği ve gelecekteki Pediatrik müdahaleler ve kök hücre Bankacılığı IPSC içine yeniden programlama için benzersiz bir tür temsil eder. Burada sunulan Protokolü ayıklamak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam açıklanır ve birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre kültürü çalışmalarının ve episomal üreten tamamen kimyasal olarak tanımlanmış kültür bu hücreler pluripotent kök hücrelerden indüklenen insan rekombinant vitronectin ve E8 orta kullanan koşullar. -Akış Sitometresi, confocal görüntüleme, teratoma oluşumu ve transkripsiyon profil oluşturma – sıkı yöntemleri uygulayarak yeni satırlar karakterizasyonu ayrıca açıklanmıştır. Yeni oluşturulan satırları işaretleri embriyonik kök hücre – Oct3/4A, MicroRNAs, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-SSEA-1 işaretçisi için negatif olurken hızlı. Kök hücre hatları teratomas scid-bej farelerde 6-8 hafta içinde oluşturmak ve teratomas doku tüm üç germ katmandan temsilcisi içerir. Transkripsiyon hatlarını profil oluşturma genel ifade Mikroarray veri bioinformatic pluripotency değerlendirme algoritması göndererek tüm satırları pluripotent sayılır ve bu nedenle, bu yaklaşım hayvan test için cazip bir alternatif. Yeni IPSC hatları kolayca ayırt etme ve doku Mühendisliği optimizasyonu içeren aşağı akım deneylerde kullanılabilir.
Introduction
İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) potansiyel hücre replasman tedavileri, hastalık ve gelişimsel modelleme ve uyuşturucu ve toksikolojik tarama1,2,3hakkında görülmemiș. Yedek terapiler kavramsal olarak hücre enjeksiyon tarafından elde edilebilir, In vitro doku (örneğin kalp yamalar) implantasyon ayrıştırılan veya rejenerasyon doku Mühendisliği aracılığıyla rehberlik. Amniyon sıvısı (AFSC) ve membran kök hücre (AMSC) olan hücreler bu müdahaleler için mükemmel bir kaynak ya da doğrudan4,5,6,7 veya yeniden programlama için başlangıç bir hücre nüfus olarak Pluripotent8,9,10,11,12.
Erken yaklaşımlar kullanılan tanımsız kültür sistemleri veya gerektirecektir genomik entegrasyonu gerektiren yöntemleri yeniden programlama yapıları9,10,11,12. Düz-se bile daha az tanımlanmış membran ek matris (BMM), IPSC amniyotik sıvı epitel hücreleri oluşturmak için kullanılan daha yeni yapılan bir çalışmada xeno-Alerjik orta istihdam. Ancak, teratoma oluşumu tahlil In vitro ve moleküler verileri zenginliği ile birlikte çalışmaya dahil değildi. Amniyotik sıvı epitel hücreleri yenidoğan fibroblastlar13ile karşılaştırıldığında bir kabaca 8-fold daha yüksek programlama verimliliği için bulunamadı. Başka bir çalışmada, amniyotik sıvı Mezenkimal kök hücrelerden de bir çok daha yüksek verimlilik ile12IPSC içine yeniden programlanan bulunmuştur.
Pluripotent kök hücre tüm 3 germ tabakalarının doku temsilcisi ayrıştırılan ve böylece geniş bir potansiyele sahip. Pediatrik hastalarda hasat, yeniden programlama ve onların Otolog amniyotik sıvı kök hücre doku Mühendisliği prenatally faydalı olacağını ve amniyotik membran kök hücreleri perinatally. Ayrıca, fetal kök hücreleri (erişkin kök hücreleri14,15düşük) farklılaşma nispeten düşük düzeyde teorik olarak IPSC16kaynak hücrelerden epigenetik önyargı gözlenen tutma ele yardımcı olabilir.
Burada amniyotik sıvı yeniden programlama için bir iletişim kuralı mevcut ve membran kök hücre içinde pluripotency için kimyasal olarak E8 orta xeno-Alerjik episomal plazmid18kullanılarak rekombinant vitronectin17 tarihinde (VTN) tanımlanan.. En büyük avantajı amniyotik sıvı ve membran hücre hücre yeniden programlama için bir kaynak olarak kullanılabilirliklerini öncesi yatıyor ve perinatally ve bu nedenle bu yaklaşım esas olarak Pediatrik doku Mühendisliği içine araştırma yararlanacak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cenin kök hücre nesilden IPSC başlangıç aşamasında kaynak hücreleri ayıklama fetal dokularda, kültür, genişleme ve episomal programlama plazmid getirilmesi üzerine kuruludur. Bu aşama yaklaşık 14-18 gün önce ilk tam olarak programlanmış kolonileri genişletilebilir bir kültür döneme göre izlenir. Olgunlaşma IPSC klonların son aşamasıdır. Amniyotik membran kök hücre ilk çıkarma bir kombine mekanik ve Enzimatik sindirim amnion aracılığıyla elde edilir. Bulduğumuz bu hücre ile en yüks…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Fonds Medizinische Forschung Zürih Üniversitesi, Forschungskredit Zürih Üniversitesi, SCIEX NMSCh altında Arkadaş grupları 10.216 ve 12.176, Swiss, Kardiyoloji Derneği, İsviçre Ulusal Bilim tarafından desteklenmiştir Kuruluşu’nun altında Grant [320030-122273] ve [310030-143992], 7. çerçeve programı, hayat Vana, Grant [242008], Olga Mayenfisch Vakfı, EMDO Vakfı, Zürih Üniversitesi Hastanesi açılış hibe 2012 Avrupa Komisyonu ve iç Mitchell Kanser Enstitüsü finansman.
Materials
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette – transfection pipette Neon device – transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip – transfection tip Neon tube – transfection tube buffer R – resuspension buffer buffer E – electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data – *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data – *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
- Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
- Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
- Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
- Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
- Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
- Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
- Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
- Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
- Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
- Kang, N. -. H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Müller, F. -. J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
- Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
- Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
- Müller, F. -. J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
