تنقية المقصورة غشاء للتدهور المرتبطة هيولى المستضدات خارجية المنشأ في العرض التقديمي عبر
概要
الأسلوب الموصوفة هنا هو بروتوكول عزلة حويصلة جديدة، مما يسمح لتنقية المقصورات الخلوية حيث تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ بتدهور هيولى المرتبطة في العرض التقديمي عبر.
Abstract
الخلايا الجذعية (DCs) قادرون على درجة عالية من تجهيز وتقديم المستضدات خارجية المنشأ المدخلة على الفئة الرئيسية هيستوكومباتيبيليتي (MHC) أنا جزيئات تعرف أيضا باسم الصليب-العرض التقديمي (CP). CP يلعب دوراً هاما ليس فقط في تحفيز السذاجة CD8+ تي الخلايا وذاكرة CD8+ تي الخلايا للمعدية وحصانة الورم بل أيضا في المنظمة سيلفاكتينج الخلايا السذاجة تي استعطال خلية T أو حذف خلايا T. على الرغم من أن الآلية الجزيئية الحرجة من حزب المحافظين توضيح، تراكم الأدلة تشير إلى أن تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ عن طريق المرتبطة هيولى تدهور (أراد) بعد التصدير غير الكلاسيكية اندوسيتيك الأجزاء الأخرى. الأوصاف لهذه المقصورات اندوسيتيك حتى وقت قريب، كانت محدودة لأن هناك لا علامات جزيئية محددة خلاف المستضدات خارجية المنشأ. الأسلوب الموصوفة هنا هو بروتوكول عزلة حويصلة جديدة، مما يسمح لتنقية هذه المقصورات اندوسيتيك. باستخدام هذا ميكروسومي المنقي، نحن تشكيلها أراد مثل النقل، أوبيكويتينيشن، وتجهيز مستضد خارجية في المختبر، مما يوحي بأن نظام ubiquitin-بروتوزوم معالجة مستضد خارجية بعد التصدير من هذا حجرة الخلوية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول كذلك لأنواع الخلايا الأخرى لتوضيح الآلية الجزيئية لحزب المحافظين.
Introduction
MHC أنا يعبر عن الجزيئات على السطح لكافة الخلايا المنواه، مع الببتيدات مستضدي قصيرة مستمدة من المستضدات الذاتية، التي تتم معالجتها بواسطة نظام ubiquitin-بروتوزوم في سيتوسول1. بعد المعالجة، تنقل الناقل الببتيد الصنبور الببتيدات المستضديه في التجويف هيولى (ER). في التجويف ER، سلسلة من مرافقين محددة مساعدة في تحميل الببتيد والطي الصحيحة من MHC أنا معقدة. هذه السلسلة من الجزيئات تسمى مجمع الببتيد-تحميل (PLC)، مشيراً إلى أن لائحة حجرة مركزية الببتيد تحميل عند MHC2. بعد تحميل، ببتيد MHC أنا الجزيئات يتم نقلها إلى سطح الخلية وتلعب دوراً رئيسيا في النظام المناعي التكيفي كعلامات الذاتية، وتمكن CD8+ اللمفاويات T السامة للخلايا (CTLs) للكشف عن الخلايا السرطانية أو العوامل المعدية بمولده الببتيدات من البروتينات غير المتمتعة بالحكم الذاتي3.
في مستضد تقديم الخلايا (APC)، الببتيدات مستضدي من المستضدات خارجية المنشأ كما عرضت عليها MHC أنا4،5،6،،من78 عبر حزب المحافظين، الذي يتم أساسا من قبل وحدات تحكم المجال Dc10،،من911. CP أمر ضروري سواء بالنسبة لتنشيط السذاجة CD8+ تي الخلايا وذاكرة CD8 الخلايا+ تي في مكافحة الأمراض المعدية ومكافحة الأورام CTLs12،13، وفي الحفاظ على التسامح المناعية قبل يخمد من الذاتي بالإنابة السذاجة تي الخلايا14،15. حزب المحافظين يلعب العديد من الأدوار الهامة في النظام المناعي التكيفي، إلا أن الآليات الجزيئية لحزب المحافظين ولم توصف بالتفصيل. وكشفت الدراسات السابقة لحزب المحافظين أن المستضدات خارجية المنشأ كانت المترجمة لائحة ودخلول على حد سواء، وتم معالجتها بواسطة أراد، مما يوحي بأن تنقل المستضدات خارجية المنشأ من دخلول إلى لائحة للتجهيز مثل أراد والببتيد تحميل16 . ومع ذلك، تشير الأدلة تراكم إلى الاضطلاع بتحميل الببتيد CP لا لائحة وإنما في أماكن اندوسيتيك غير الكلاسيكية، التي لديها أيضا السمات المميزة لل ER (الشكل 1)17،18 ،19،،من2021. لتجنب تدهور السلائف ببتيد مستضدي بنشاط أمينوبيبتيداسي عالية يحدث22 في سيتوسول والتجهيز والببتيد تحميل في حزب المحافظين في المنطقة القريبة من هذه المقصورات اندوسيتيك غير الكلاسيكية (الشكل 1). على الرغم من أن الأوصاف من هذه المقصورات اندوسيتيك مثيرة للجدل، وهناك لا جزيئات محددة موجودة عدا المستضدات خارجية المنشأ في هذه المقصورة.
أراد هو مسار خلوية، وعلى وجه التحديد إلى إزالة البروتينات تجمعات لائحة. في مسار أراد، تنقل عبر غشاء ER إلى السيتوبلازم ريتروجراديلي تجمعات البروتينات ومعالجتها بواسطة نظام ubiquitin-بروتوزوم23،24،25. عندما يتم نقل الجزيئات الكبيرة، مثل البروتينات، عن طريق بلير الدهن، هذه الجزيئات المرور عبر جهاز جزيئي يسمى ترانسلوكون، مثل مجمع Sec61 وديرلان المعقدة في أية26، ومجمع توم وتيم المعقدة في 27من الميتوكوندريا. عندما أضيف مناشئ المستضدات تنقل عبر غشاء ER، أنهم يجب أن تخترق bilayer الدهني في المجمع مع ترانسلوكونس، مثل مجمع Sec61. الأسلوب الموصوفة هنا تنقية حويصلة المستهدفة باستخدام هذه الجزيئات اختراق الغشاء كعلامات للمقصورات اندوسيتيك.
الأسلوب الموصوفة هنا بروتوكول تنقية حويصلة جديدة تستخدم في الخلية مثل العاصمة خط DC2.428 وبيوتينيلاتيد أوفالبومين (بوفا) مستضد خارجية. تم تنقية المقصورات اندوسيتيك من ستريبتافيدين (SA)-المغناطيسي الخرز استخدام بوفا اختراق الغشاء كصانع. في هذا ميكروسومي المنقي، بعض مناشئ أضيف بوفا المحافظة لا تزال في غشاء الكسور ولكن نقلها إلى الخارج من ميكروسومي ومن ثم أوبيكويتيناتيد ومعالجتها في المختبر29. هذا المنقي ميكروسومي الواردة اندوسيتيك الخاصة بحجرة البروتينات ليس فقط، بل أيضا البروتينات ER-المقيم أراد والببتيد تحميل المعقدة؛ مما يدل على أن حجرة الخلوية حجرة اندوسيتيك المحتملين لحزب المحافظين29. هذا البروتوكول لا يتوقف على نوع المستضدات خارجية المنشأ، وينطبق أيضا لمجموعات فرعية DC الأخرى وأنواع الخلايا الأخرى، مثل الضامة وخلايا ب وخلايا بطانية، لتوضيح إليه الجزيئي الدقيق لوحدات تحكم المجال Dc CP يتقن.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدراسات السابقة لحزب المحافظين، تراكمت المستضدات خارجية المنشأ مدرجة في المنطقة المحظورة من دخلول المتأخرة أو ER بالفحص المجهري إيمونوفلوريسسينت16،30،،من3132. ومن المقدر أن أراد مثل النقل والتجهيز من المستضدات خارجي…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل معتمد من قبل جامعة تاكاساكي للصحة والرعاية الاجتماعية.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
参考文献
- van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
- Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).
- McDevitt, H. O. Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response. Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).
- Bedoui, S., et al. Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells. Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).
- Segura, E., Villadangos, J. A. Antigen presentation by dendritic cells in vivo. Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).
- Cheong, C., et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 143 (3), 416-429 (2010).
- Henri, S., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).
- Shortman, K., Heath, W. R. The CD8+ dendritic cell subset. Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Nair-Gupta, P., Blander, J. M. An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation. Front Immunol. , (2013).
- Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. Cross-presentation by dendritic cells. Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).
- Kurts, C., et al. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).
- Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).
- Bonifaz, L., et al. Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance. J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).
- Heath, W. R., Carbone, F. R. Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance. Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).
- Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells. Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).
- Houde, M., et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).
- Guermonprez, P., et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).
- Lizée, G., et al. Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain. Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).
- Basha, G., et al. A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway. Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).
- Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation. Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).
- Wiertz, E. J., et al. Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction. Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).
- Hampton, R. Y. ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation. Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).
- Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).
- Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).
- Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. Mitochondrial protein homeostasis. IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells. Heliyon. , (2016).
- Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules. Science. 267 (5195), 243-246 (1995).
- Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells. Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).
- Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tampé, R., Cresswell, P. Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).
- Saveanu, L., et al. IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation. Science. 325 (5937), 213-217 (2009).
- Zehner, M., et al. The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells. Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).
