这项工作描述了使用成熟小鼠T细胞系的染色质免疫沉淀(ChIP)的方案。该方案适用于研究特定启动子位点或全基因组特异性组蛋白标记的分布。
信号途径通过调节不同水平的染色质结构来调节基因表达程序,例如通过组蛋白尾的翻译后修饰(PTM),组蛋白变体的规范组蛋白的交换和核小体驱逐。这种调节需要在定义为增强子的调节元件上招募染色质修饰酶的信号敏感转录因子(TF)的结合。了解信号级联如何调节增强子活性需要对TFs,染色质修饰酶的结合以及特定组蛋白标记和组蛋白变体的占据进行综合分析。染色质免疫沉淀(ChIP)测定利用高度特异性的抗体免疫沉淀特异性蛋白质/ DNA复合物。纯化的DNA的随后分析允许鉴定由抗体识别的蛋白质占据的区域。这个工作描述了一个有效率的协议组蛋白在成熟小鼠T细胞系中的ChIP ChIP。所提出的方案允许在合理的时间范围内以高重现性进行ChIP测定。
发育,分化和体内平衡取决于通过调节染色质结构的信号事件建立的特定基因表达程序,从而确定特定基因是否以细胞和时间特异性方式被激活或抑制。在T细胞发育期间,必须建立特异性基因表达程序,以正确地确定T细胞前体从双负(DN)到单阳性(SP)状态的成熟,通过几个中间阶段1 。几个实验室2,3,4,5,6在前几年广泛研究了T细胞发育过程中基因表达程序的动态调控。
通过组蛋白的翻译后修饰(PTM),交换具有组蛋白变体,核小体迁移和DNA甲基化的规范组蛋白调节基因的ON / OFF转换。几组已经研究了PTM和组蛋白变体的全基因组分布,以确定在近端和远端调节区7,8,9,10处与不同染色质状态相关的标记。信号级联通过在特异性增强子元件交换正染色质修饰酶(也称为染色质修饰剂)来编排动态染色质调节。这些染色质调节剂通过例如动态组蛋白甲基化和乙酰化来调节染色质结构,从而调节转录产物。 Notch信号通路11,12,13 ,14。
动态组蛋白PTMs;与组蛋白变体交换;并且可以通过染色质免疫沉淀(ChIP)测定来研究组蛋白,转录因子和辅因子的动态占据。使用高度特异性的抗体来纯化特定的DNA-蛋白复合物,通过定量PCR(qPCR)分析纯化的DNA。深度测序(ChIP-Seq);或者现在不太频繁地与微阵列杂交(ChIP-ChIP)。
由于细胞的裂解,染色质的剪切和/或抗体的低特异性的并发症,ChIP测定有时是有挑战性的。已经采用了几种策略来改进协议,就像NEXSON 15一样 。使用冷却水浴超声波器避免样品加热,这可能会损害正在研究的蛋白质上存在的表位,但剪切样品所需的能量分散在水中。随着防止能量分散的聚焦超声波装置的发展,进一步改进。因此,聚焦超声波设备允许改善细胞裂解和染色质剪切,消除操作者诱导的变异并显着增加再现性。
该工作描述了一种协议( 图1中的示意图 ),用于有效地在称为E2-10HA 16,17的成熟小鼠T细胞系中执行组蛋白的ChIP。 T细胞通常难以溶解,染色质的剪切已被揭示为低效率。在使用冷却聚焦超声波器的该方案中,针对E2-10HA小鼠T细胞系优化了细胞数量,裂解缓冲液和剪切设置。该协议允许人们在合理的时间内以高重现性执行ChIP。事实上,它需要大约两天剪切染色质并评估剪切的质量,三天进行免疫沉淀,逆转交联并纯化DNA。
ChIP是一种有效的技术,用于调查蛋白质或其PTM是否在特定基因组区域富集。由于生物或技术原因,ChIP测定结果通常具有挑战性。生物学原因有很多,包括蛋白质与DNA的弱或间接结合。还存在技术限制,例如有限的抗体特异性和低效细胞裂解或染色质剪切。故障排除指南( 表5 )可帮助读者解决ChIP测定可能遇到的问题。
该协议利用冷却聚焦超声波装置,可以有效地剪切成熟的小鼠T细胞系的染色质。协议的主要关键步骤由染色质的剪切表示,染色质必须始终针对每种细胞类型进行优化。建议改变细胞数量和超声处理循环次数。而且,她样品中SDS沉淀物的存在会对培养效率产生负面影响,SDS沉淀缓冲液可能在冰上裂解细胞时形成。在这种情况下,最好在室温下裂解后样品孵育数分钟以减少SDS沉淀物的存在。建议优化方案以获得200至500 bp之间的剪切片段,并在进行免疫沉淀前始终评估样品的剪切质量。此外,必须针对每种抗体优化注射时间,抗体和/或细胞的量以及洗涤条件。
使ChIP程序成功的另一个关键步骤是抗体的选择,因为低特异性抗体显着降低免疫沉淀的效率。以前,统一的质量检测程序允许评估市场上可获得的几种抗体的特异性 ss =“xref”> 19。筛选管道基于斑点印迹,Western印迹和ChIP,提供了适用于ChIP 19的高品质试剂列表。最近,使用高密度组蛋白肽微阵列平台评估了几种市售抗体的特异性,允许建立抗体特异性数据库20 。读者可以使用这个有用的工具来识别可用于ChIP实验的最具体的抗体。
该协议尚未对原始T细胞进行测试,在这种情况下,读者应参考在主要T细胞3,4,21上成功执行ChIP的其他已发布协议。值得注意的是,该方案已经成功地用于在小鼠祖细胞T细胞系以及小鼠内皮细胞系上进行ChIP。
ove_content“> 5×10 6个细胞应用于每次免疫沉淀用于组蛋白标记的分析,因为该方案也可以合适,通过一些优化,在TF或辅因子上进行ChIP,最好增加细胞数量用于这些情况下的免疫沉淀。为了达到每个实验所需数量的细胞,在稀释稀释缓冲液中的染色质稀释之前,可以将更多等分的剪切裂解物合并在一起。也可以修改该方案以对不直接与DNA结合的内源蛋白进行ChIP。在这种情况下,可能需要预先固定蛋白质 – 蛋白质交联剂( 例如,二甲基己二亚胺酯,DMA)(有关更多信息,请参阅附录B )。先前通过过表达与生物素标签融合的蛋白质来实现ChIP对辅因子的成功表现。在这种情况下,用链霉抗生物素蛋白 – 缀合物纯化蛋白质22进行了预先固定的DMA。
The authors have nothing to disclose.
我们非常感谢P.Käse和T. Schmidt-Wöll的优秀技术援助。这项工作得到了德国研究基金会(DFG)(德国研究基金会),马克斯·普朗克社会和弗莱堡的EXC 294的合作研究资助TRR81和海森堡计划(BO 1639 / 5-1)以及心肺系统(ECCPS)在吉森至TB
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5593 | |
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5592 | |
Agilent Tapestation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | |
Covaris S220 AFA System | Covaris | 500217 | |
dimethyl adipimidate (DMA) | Thermo Fisher Scientific | 20660 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Pan-Biotech | 1502-P121301 | |
Formaldehyde (FMA) | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21980-032 | |
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5280-02 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Peptone primatone | Sigma-Aldrich | P4963-100G | |
Phase Lock Gel Heavy 2 ml | 5 Prime | 2302830 | |
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) | Roth | A156.2 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | GIBCO | 14190-094 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
Tube AFA Fiber & Cap | Covaris | 520081 |