إثراء مجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة

أمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض) وأمراض بريون وثيق الصلة بروتينوباثيس تتميز بتراكم تدريجي انخفاض المجاميع البروتين المنظفات الذوبان في الدماغ مع مرافقة المعرفية. ^{1 ,} ويعتقد أن تلعب دوراً مركزياً في المسببات والفيزيولوجيا المرضية لهذه الأمراض الأعصاب ² هذه الميزة المرضية المشتركة. ² هذه المجاميع وعادة ما تتألف من ألياف اميلويد البوليمرية، التي تتكون من تكرار وحدات من البروتين تجمعات العارضة عبر β-الهيكل. ^{1 , 2 , 3 , 4} المتحلل، المجاميع اميلويد هي شديدة المقاومة تمسخ الكيميائية أو الحرارية وسولوبيليزيشن،³ التي تشكل تحديات فريدة من نوعها لتنقية بهم، تحليل ودراسة عن طريق التقنيات الحيوية التقليدية. ^{2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} لا غرابة، الكسر البروتين تستعصي على الحل المنظفات قد تم تركيز الكثير من البحوث في الفسيولوجيا المرضية لأمراض الأعصاب التي تشمل تراكم البروتينات تجمعات. ^{6 , 12 , 13 , 14}

كثيرا ما استخدمت تقنيات تجزئة البيوكيميائية لإثراء الكسر تستعصي على الحل المنظفات من homogenates الدماغ تشريح الجثة. ^{6 , 12 , 13 , 14} واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً يشمل استخراج متسلسلة من الأنسجة هوموجيناتيس مع المخازن المؤقتة والمنظفات الصناعية المتزايدة الصرامة، تليها تنبيذ فائق لتقسيم الكسور القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان. ^6،بروتوكول¹⁴ تجزئة متسلسلة استخداماً ينطوي على تجانس عينات الأنسجة المجمدة في منطقة عازلة خالية من المنظفات منخفضة ملح (LS) والكريات الناتجة غير قابلة للذوبان ثم تستخرج تسلسلياً مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على الملح عالية، والمنظفات غير الأيونية، السكروز عالية، المنظفات الأيونية، وأخيراً تشاوتروبيس مثل اليوريا. ^{6 , 14} هو عيب واضح من هذه البروتوكولات تجزئة متسلسلة وقت كبير والتزام العمل المطلوب لإكمال لهم. بما في ذلك التجانس وتنبيذ فائق، يمكن اتخاذ بروتوكول نموذجي خمس خطوات تجزئة عدة ساعات أو حتى أيام لاستكمال. ^{4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18} بالإضافة إلى ذلك، يظل العديد من البروتين باثولوجي المجاميع غير قابلة للذوبان في جميع ولكن ظروف أقسى^19،20 معظم الكسور التي تم إنشاؤها ذات قيمة محدودة. وهكذا، خطوات تجزئة أقل صرامة استخدام تركيزات عالية من الملح والمنظفات غير الأيونية زائدة عن الحاجة إلى حد كبير.

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن المنظفات الأيونية ن-سولفات-ساركوسيني (ساركوسيل) مرشح ممتاز لبروتوكول مبسط تجزئة منظفات في خطوة واحدة. ^{5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23} كمطهر يشوه، ساركوسيل صرامة ما يكفي جعل الغالبية العظمى من البروتينات مطوية أصلاً في الدماغ دون سولوبيليزينج المجاميع البروتين تجمعات تتألف من اميلويد بيتا (Aβ)،^6،11 تاو فوسفوريلاتيد (بتاو)،⁶ “القطران الحمض النووي” ملزم بروتين 43 (ماساتشوستس-43)،¹⁴ ألفا-سينوكلين أو الرعاش^{13 12،}،²³ أو U1 الصغيرة النووية ريبونوكليوبروتينس (U1 سنرنبس) مثل U1-70 ك. ^{5 , 21 , 22} كما ساركوسيل أقل صرامة من كبريتات دوديسيل الصوديوم المنظفات أنيونى في كل مكان (SDS)، فإنه يحافظ على أشكال oligomeric أقل متانة من المجاميع تجمعات البروتين التي لا يمكن أن تصمد أمام معاملة الحزب الديمقراطي الصربي. ⁹

سابقا، يمكننا وصف بروتوكولا المنظفات-تجزئة مختصر الذي حقق نتائج قابلة للمقارنة للمنهجيات تجزئة متسلسلة أكثر شاقة. ⁵ بحذف الخطوات تجزئة أقل صرامة، استطعنا أن وضع بروتوكول تجزئة خطوة واحدة سهلة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة. ⁵ هذا البروتوكول التفصيلية الموضحة هنا مناسبة تماما لمجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية تتراوح من النشاف الغربية وفحوصات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي misfolding البروتين وظيفية والبذر التجميع. ^{5 , 6 , 21}