Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить простой и недорогой подход к сбору эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) и приготовлению белковых экстрактов, которые могут быть использованы в протеомических применениях ниже по течению, таких как масс-спектрометрия с аффинной очисткой (AP-MS ).
Анализ белково-белковых взаимодействий (ИЦП) стал незаменимым подходом к изучению биологических процессов и механизмов, таких как клеточная сигнализация, развитие организма и заболевание. Часто желательно получить информацию PPI, используя материал in vivo , чтобы получить наиболее естественное и непредвзятое представление о сетях взаимодействия. Плодовая мушка Drosophila melanogaster – отличная платформа для изучения ИЦП in vivo и поддается прямым подходам к изоляции материала для биохимических экспериментов. В частности, эмбрионы плодовой мушки представляют собой удобный тип ткани для изучения ИЦП, из-за легкости сбора животных на этой стадии развития и того факта, что большинство белков выражается в эмбриогенезе, тем самым обеспечивая соответствующую среду для выявления большинства ИЦП. Здесь мы представляем протокол для сбора эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г), что является идеальным количеством для широкого спектраПротеомических приложений, включая анализ ИЦП методом аффинной очистки-масс-спектрометрии (АР-МС). Мы описываем наши конструкции для клеток 1 L и 5 L для коллекций эмбрионов, которые можно легко и недорого настроить в любой лаборатории. Мы также предоставляем общий протокол для сбора эмбрионов и экстракции белка для получения лизатов, которые могут быть непосредственно использованы в нисходящих приложениях, таких как AP-MS. Наша цель – предоставить доступным средствам для всех исследователей для проведения анализа ИЦП in vivo .
Генетические экраны, а в последнее время геномные подходы коренным образом изменили изучение биологических функций. Однако важная клеточная информация кодируется в белках и их ансамбле взаимодействующих партнеров. В то время как традиционные экраны генетических модификаторов могут идентифицировать компоненты, ограничивающие скорость, и восстанавливать косвенные взаимодействия, сила протеомических подходов заключается в их способности идентифицировать полные сети немедленного взаимодействия интересующих белков. Таким образом, Proteomics является ценным ортогональным методом для изучения биологических систем и дополняет геномику, транскриптомику и традиционные генетические экраны. Эффективность аффинной очистки-масс-спектрометрии (AP-MS) оказалась мощным подходом к изучению белково-белковых взаимодействий (ИЦП) в их родной среде в клетках и тканях 1 , 2 . Этот метод позволяет идентифицировать прямые или косвенные взаимодействия при конкретном развитииАльфах или тканевых контекстах, и был успешно использован для идентификации нескольких новых ИЦП в различных вариантах развития (рассмотрен в ссылке 1 ). Несмотря на бесспорный успех исследований ИЦП, большинство из них было проведено в культивируемых клетках, в которых представляющие интерес белки «приманки» были сверхэкспрессированы. Существует два вопроса с изучением ИЦП в культуре клеток: во-первых, конкретная клеточная линия не может обеспечить полный набор взаимодействий из-за отсутствия экспрессии определенных белков. Во-вторых, высокая избыточная экспрессия, обычно используемая в таких анализах, может приводить к возникновению артефактов, таких как неправильное распределение белка или идентификация ложноположительных взаимодействий.
Оба этих ограничения можно преодолеть, проанализировав ИЦП in vivo . Ограничивающим этапом в таких экспериментах является доступность исходного материала для очистки белковых комплексов. Drosophila melanogaster уже давно используется в качестве модели для функционального анализаSis, и в последнее время также была продемонстрирована отличная система для изучения ИЦП in vivo . Эмбриогенез дрозофилы представляет собой особенно привлекательный тип ткани для изучения ИЦП, поскольку эмбрионы можно легко собирать в больших количествах, а также потому, что большинство генов (> 88%) экспрессируются в течение эмбриогенеза, тем самым обеспечивая богатую среду in vivo для выявления соответствующих ИЦП 3 .
Традиционно в биохимических исследованиях у мух использовались очень крупномасштабные коллекции эмбрионов (100-150 г), такие как необходимые для очистки функциональных транскрипционных лизатов 4 , 5 . Предыдущие исследования AP-MS у Drosophila также нуждались в большом количестве эмбрионов (5-10 г), поскольку они полагались на двухступенчатый подход к очистке, такой как тандемная аффинная очистка (TAP), с соответствующей потерей материала на каждой стадии 6 . Большой amounTs исходного материала потребовало создания коллекций эмбрионов в больших популяционных клетках, которые могут быть как дорогостоящими (при покупке на коммерческой основе), так и трудоемкими для поддержания и очистки 7 , 8 , 9 .
Недавние достижения в разработке одностадийных аффинно-очистных подходов, а также возрастающая чувствительность масс-спектрометров на порядок уменьшили необходимое количество исходного материала. Используя теги, такие как стрептавидинсвязывающий пептид (SBP) или зеленый флуоресцентный белок (GFP) и начиная с менее 1 г эмбрионов, можно выделить количества белка приманки и взаимодействующих компонентов, которые были бы достаточны для идентификации посредством Масс-спектрометрия 10 , 11 .
Цель представленного здесь протокола – помочь исследователям overcoЯ воспринимаю барьер для биохимического анализа ИЦП in vivo . С этой целью мы предлагаем простую и недорогую процедуру для сбора эмбрионов дрозофилы в среднем масштабе (0,5-1 г) с последующим одностадийным приготовлением цельноклеточных белковых экстрактов, которые пригодны для последующего анализа с помощью AP-MS или других подходов , Наш метод основан на использовании специально изготовленных 1-L или 5-L популяционных клеток, которые могут быть легко получены любой лабораторией. Кроме того, условия экстракции, представленные здесь, были подтверждены в нескольких исследованиях как в культивируемых клетках, так и in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Протокол, представленный здесь, представляет собой простую и общую процедуру для создания популяционных клеток дрозофилы в среднем масштабе и получения экстрактов белков цельной клетки из эмбрионов. Полученные экстракты могут быть использованы во множестве последующих пр?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят членов лаборатории Veraksa за полезные комментарии к рукописи и предложения по совершенствованию протокола. AV был поддержан грантами NIH GM105813 и NS096402. LY был поддержан Университетом штата Массачусетс Бостон Sanofi Genzyme Докторантура.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |