Middelgrote voorbereiding van<em> Drosophila</em> Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten
概要
Het doel van dit protocol is om een eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).
Abstract
Analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI's) is een onontbeerlijke aanpak geworden voor het bestuderen van biologische processen en mechanismen, zoals celsignaalvorming, ontwikkeling van organismen en ziekte. Het is vaak gewenst om PPI-informatie te verkrijgen door gebruik te maken van in vivo materiaal, om de meest natuurlijke en onpartijdige weergave van de interactie netwerken te verkrijgen. De vruchtvlieg Drosophila melanogaster is een uitstekend platform om PPI's in vivo te bestuderen en leent zich op eenvoudige aanpakken voor isolatiemateriaal voor biochemische experimenten. In het bijzonder vormen vruchtvliegenembryo's een geschikt type weefsel om PPI's te bestuderen door het gemakkelijk verzamelen van dieren in dit ontwikkelingsfase en het feit dat de meeste eiwitten uitgedrukt worden in embryogenese, waardoor een relevante omgeving wordt verschaft om de meeste PPI's te onthullen. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g), wat een ideale hoeveelheid is voor een breed scala aanProteomische toepassingen, inclusief analyse van PPI's door affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS). We beschrijven onze ontwerpen voor 1 liter en 5 liter kooien voor embryo collecties die gemakkelijk en goedkoop in elk laboratorium kunnen worden opgezet. Wij bieden ook een algemeen protocol voor embryo-collectie en eiwit extractie om lysaten te genereren die direct kunnen worden gebruikt in downstream toepassingen zoals AP-MS. Ons doel is om alle onderzoekers een toegankelijke manier te bieden om de analyses van PPI's in vivo uit te voeren .
Introduction
Genetische schermen en recentere genomische benaderingen hebben de studie van biologische functies ge revolutioneerd. Echter, belangrijke cellulaire informatie is gecodeerd in eiwitten en hun ensemble van interactieve partners. Terwijl traditionele genetische modificatieschermen de snelheidsbeperkende componenten kunnen identificeren en indirecte interacties herstellen, ligt de sterkte van de proteomische benaderingen in hun vermogen om directe interactie-netwerken van eiwitten van belang te identificeren. Proteomics is dus een waardevolle orthogonale methode om biologische systemen te bestuderen, en complementeert genomics, transcriptomics en traditionele genetische schermen. Affiniteit zuiverings-massaspectrometrie (AP-MS) is bewezen een krachtige aanpak om eiwit-eiwitinteracties (PPI's) in hun natuurlijke omgeving in cellen en weefsels 1 , 2 te bestuderen. Deze methode maakt het mogelijk om directe of indirecte interacties bij specifieke ontwikkeling te identificerenAl fases of weefselcontexten, en is succesvol gebruikt om meerdere nieuwe PPI's te identificeren in een verscheidenheid aan ontwikkelingswegen (onderzocht in referentie 1 ). Ondanks het onbetwiste succes van PPI-studies, zijn de meeste van hen uitgevoerd in gekweekte cellen, waarin de 'aas' eiwitten van belang zijn overexpresseerd. Er zijn twee problemen bij het bestuderen van PPI's in celcultuur: eerst kan een specifieke cellijn geen volledige complement van interacties verschaffen als gevolg van het gebrek aan expressie van bepaalde eiwitten. Ten tweede kan hoge overexpressie die gewoonlijk bij dergelijke analyses wordt gebruikt, leiden tot artefacten zoals eiwit misfolding of identificatie van valse positieve interacties.
Beide deze beperkingen kunnen worden overwonnen door PPI's in vivo te analyseren. Een beperkende stap bij dergelijke experimenten is de beschikbaarheid van het uitgangsmateriaal voor het zuiveren van eiwitcomplexen. Drosophila melanogaster is al lang gebruikt als model voor functionele analyseSis, en recentelijk is ook aangetoond dat het een uitstekend systeem is voor het bestuderen van PPI's in vivo . Drosophila embryogenese vertegenwoordigt een bijzonder aantrekkelijk weefsel type om PPI's te bestuderen, omdat embryo's gemakkelijk in grote hoeveelheden kunnen worden verzameld, en ook omdat de meeste genen (> 88%) uitgedrukt worden in de loop van de embryogenese, waardoor een rijk in vivo omgeving verschaft wordt voor het opsporen van relevante PPI's 3 .
Traditioneel gebruikten biochemische studies in vliegen zeer grote embryo-collecties (100-150 g), zoals die welke nodig zijn voor het zuiveren van functionele transcriptieve lysaten 4 , 5 . Vorige AP-MS studies in Drosophila hadden ook grote hoeveelheden embryo's nodig (5-10 g), omdat ze vertrouwden op een tweestapszuiveringsbenadering zoals tandemaffiniteitszuivering (TAP), met het bijbehorende verlies van materiaal bij elke stap 6 . Grote amounTs van het uitgangsmateriaal moest het opzetten van embryo-collecties in grote populatiekooien, die zowel duur als commercieel gekocht kunnen worden en tijdrovend zijn om 7 , 8 , 9 te onderhouden en te reinigen.
Recente vooruitgang in de ontwikkeling van een-stap-affiniteitszuiveringsbenaderingen, evenals de toenemende gevoeligheid van massaspectrometers, hebben de benodigde hoeveelheid uitgangsmateriaal verminderd met een orde van grootte. Met behulp van labels zoals het streptavidine bindende peptide (SBP) of groen fluorescerend eiwit (GFP) en vanaf minder dan 1 g embryo's, is het mogelijk om de hoeveelheden aas eiwit en interactie componenten te isoleren die voldoende zouden zijn om te identificeren door Massaspectrometrie 10 , 11 .
Het doel van het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is om de onderzoekers overco te helpenMij een waargenomen belemmering voor biochemische analyse van PPI's in vivo . Daartoe bieden wij een eenvoudige en goedkope procedure voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g), gevolgd door een stap bereiding van eiwitten van hele cellen die geschikt zijn voor latere analyse door AP-MS of andere benaderingen . Onze methode is gebaseerd op het gebruik van op maat gemaakte 1-L of 5-L populatiekooien die gemakkelijk door elk laboratorium kunnen worden geproduceerd. Bovendien zijn de hier getoonde extractie condities in verschillende studies gevalideerd, zowel in gekweekte cellen als in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige en algemene procedure voor het opbouwen van Drosophila populatiekooien op middelgrote schaal en het maken van eiwitten van hele cellen uit embryo's. De resulterende extracten kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen, zoals zuivering van eiwitcomplexen op affiniteitsharsen. Het is van cruciaal belang om de extractiestadies op ijs uit te voeren en sterke protease remming te gebruiken, om eiwitafbraak te minimalis…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken leden van het laboratorium Veraksa voor nuttige opmerkingen over het manuscript en suggesties voor protokolverbeteringen. AV werd ondersteund door de NIH-subsidies GM105813 en NS096402. LY werd ondersteund door de universiteit van Massachusetts Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
参考文献
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. 遺伝学. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. 遺伝学. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O’Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
