概要

Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Published: June 14, 2017
doi:

概要

Die Proteinzusammensetzung des menschlichen Mitralklappens ist noch teilweise unbekannt, weil seine Analyse durch niedrige Zellularität und damit durch eine geringe Proteinbiosynthese kompliziert wird. Diese Arbeit liefert ein Protokoll zur effizienten Extraktion von Protein für die Analyse des Mitralklappenproteoms.

Abstract

Die Analyse des zellulären Proteoms kann dazu beitragen, die molekularen Mechanismen, die den Krankheiten zugrunde liegen, durch die Entwicklung von Technologien zu erhellen, die die großflächige Identifizierung und Quantifizierung der in komplexen biologischen Systemen vorhandenen Proteine ​​ermöglichen. Das Wissen, das aus einem proteomischen Ansatz gewonnen wird, kann möglicherweise zu einem Ein besseres Verständnis der pathogenen Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, die die Identifizierung von neuartigen diagnostischen und prognostischen Krankheitsmarkern und hoffentlich von therapeutischen Zielen ermöglichen. Allerdings stellt das Herz-Mitralklappen eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse aufgrund der geringen Zellularität in der Proteoglycan- und Kollagen-angereicherten extrazellulären Matrix dar. Dies macht es schwierig, Proteine ​​für eine globale Proteomanalyse zu extrahieren. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das mit der nachfolgenden Proteinanalyse kompatibel ist, wie z. B. quantitative Proteomik und Immunoblotting. Dies kann die Korrelation der Daten betreffenG Proteinexpression mit Daten über die quantitative mRNA-Expression und nicht-quantitative immunhistochemische Analyse. In der Tat werden diese Ansätze, wenn sie zusammen durchgeführt werden, zu einem umfassenderen Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die Krankheiten zugrunde liegen, von mRNA zu posttranslationaler Proteinmodifikation. So kann diese Methode für Forscher relevant sein, die sich für die Untersuchung der Herz-Ventil-Physiopathologie interessieren.

Introduction

Der jüngste Beweis hat das Verständnis der Rollen der vielen regulatorischen Mechanismen, die nach der mRNA-Synthese auftreten, verändert. In der Tat können translatorische, posttranskriptionelle und proteolytische Prozesse die Proteinabundanz und -funktion regulieren. Das Dogma – das sagt, dass mRNA-Konzentrationen Proxies zu denen der entsprechenden Proteine ​​sind, unter der Annahme, dass Transkript-Ebenen die Hauptdeterminante der Protein-Häufigkeit sind – wurde teilweise überarbeitet. In den Transkript-Ebenen nur teilweise prognostizieren Protein-Fülle, was darauf hindeutet, dass post-Transkription Ereignisse Um die Proteine ​​innerhalb der Zellen 1 , 2 zu regulieren .

Darüber hinaus diktieren Proteine ​​schließlich die Funktion der Zelle und diktieren daher ihren Phänotyp, der dynamische Veränderungen in Reaktion auf autokrine, parakrine und endokrine Faktoren erfahren kann; Blutübertragene Vermittler; Temperatur; Medikamentöse Behandlung; Und krankheit entwickeln sich. So ist eine Expressionsanalyse, die auf die Proteinebene fokussiert ist, nützlich, um das Proteom zu charakterisieren und die kritischen Veränderungen, die ihm als Teil der Krankheitspathogenese auftreten, zu entschlüsseln.

Daher sind die Chancen, die die Proteomik zur Klärung von Gesundheits- und Krankheitsverhältnissen bietet, trotz der bestehenden technologischen Herausforderungen furchtbar. Die besonders vielversprechenden Forschungsgebiete, denen die Proteomik beitragen kann, beinhalten: die Identifizierung der veränderten Proteinexpression auf jeder Ebene ( dh ganze Zellen oder Gewebe, subzelluläre Kompartimente und biologische Flüssigkeiten); Die Identifizierung, Überprüfung und Validierung von neuartigen Biomarkern, die für die Diagnose und Prognose von Krankheiten nützlich sind; Und hoffentlich die Identifizierung neuer Proteinziele, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können, sowie für die Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität 4 .

Erfassen der Komplexität vonDas Proteom stellt eine technologische Herausforderung dar. Die aktuellen Proteomwerkzeuge bieten die Möglichkeit, eine groß angelegte Hochdurchsatzanalyse zur Identifizierung, Quantifizierung und Validierung veränderter Proteingehalte durchzuführen. Darüber hinaus hat die Einführung von Fraktionierungs- und Anreicherungstechniken, die darauf abzielen, die Interferenz zu vermeiden, die durch die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​verursacht wird, auch die Proteinidentifizierung verbessert, indem sie die am wenigsten vorhandenen Proteine ​​einschließen. Schließlich wurde die Proteomik durch die Analyse von posttranslationalen Modifikationen ergänzt, die schrittweise als wichtige Modulatoren der Proteinfunktion auftauchen.

Allerdings bleiben die Probenvorbereitung und die Proteingewinnung in den untersuchten biologischen Proben nach wie vor die begrenzenden Schritte im proteomischen Arbeitsablauf und erhöhen das Potenzial für mögliche Fallstricke 5 . In der Tat, in den meisten der molekularbiologischen Techniken, die optimiert werden müssen, sind die ersten Schritte Gewebe HomogenisierungIonen- und Zelllyse, insbesondere während der Analyse von Proteinen mit geringer Häufigkeit, für die keine Amplifikationsmethoden existieren. Darüber hinaus kann die chemische Natur von Proteinen ihre eigene Erholung beeinflussen. Zum Beispiel ist die Analyse von hoch hydrophoben Proteinen sehr schwierig, da sie während der isoelektrischen Fokussierung leicht ausfallen, während trans-Membranproteine ​​nahezu unlöslich sind (siehe Referenz 5). Darüber hinaus schafft die Gewebszusammensetzungsvariabilität eine signifikante Barriere für die Entwicklung eines universellen Extraktionsverfahrens. Schließlich, da fast alle klinischen Proben von begrenzter Menge sind, ist es unerlässlich, die Proteinpräparation mit maximaler Wiedergewinnung und Reproduzierbarkeit aus minimalen Probenmengen zu ermöglichen 6 .

Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Proteinextraktion aus dem normalen menschlichen Herzrhythmusventil, das eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse darstellt. Das normale Mitralklappe ist ein KompLex-Struktur, die zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel des Herzens liegt (Abbildung 1 ). Es spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Blutflusses vom Atrium zum Ventrikel, verhindert den Rückfluss und sorgt für die richtige Sauerstoffversorgung des ganzen Körpers, wodurch ein adäquates Herzzeitvolumen aufrechterhalten wird. Allerdings wird es oft als ein "inaktives" Gewebe betrachtet, mit einer geringen Zellularität und wenigen Komponenten, hauptsächlich in der extrazellulären Matrix. Dies liegt daran, dass unter normalen Bedingungen die residenten valvularen interstitiellen Zellen (VICs) einen ruhigen Phänotyp mit einer niedrigen Proteinbiosyntheserate 7 darstellen.

Es wurde jedoch gezeigt, dass in einem pathologischen Zustand die Anzahl der VICs in der Spongiosa zunimmt und ihre Proteinsynthese zusammen mit anderen funktionellen und phänotypischen Veränderungen aktiviert wird. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die minimalen Daten inDie Literatur konzentriert sich auf die Analyse der pathologischen Mitralklappen 9 , 10 , bei denen die erhöhte Anzahl aktivierter VICs die relativ hohe Anzahl identifizierter Proteine ​​erklären könnte.

Abschließend kann das vorliegende Protokoll dazu dienen, das Verständnis der pathogenen Mechanismen, die für Mitral-Ventil-Erkrankungen verantwortlich sind, durch die Untersuchung von Mitralklappen-Protein-Komponenten zu entwickeln. In der Tat könnte ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathologischen Prozesse dazu beitragen, das klinische Management von Ventilkrankheiten zu verbessern, deren derzeitige Indikationen für die Intervention weitgehend auf hämodynamische Überlegungen beruhen.

Protocol

In diesem Protokoll werden die menschlichen Herzen während der Multiorgan-Explantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h, Mittelwert 6 ± 2 h) von Multiorganspendern, die aus der Organtransplantation aus technischen oder funktionalen Gründen ausgeschlossen sind, trotz normaler echokardiographischer Parameter gesammelt. Sie werden an die Herz-Kreislauf-Tissue Bank von Mailand, Monzino Cardiologic Center (Mailand, Italien) für die Bank der Aorten- und Pulmonalventile geschickt. Die Mitral-posterioren Blättchen werden ni…

Representative Results

Die Extraktion und Auflösung von Proteinen im Harnstoffpuffer ist direkt mit proteomischen Methoden auf der Basis von Isoelektrofokussierung (zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) 11 und Flüssigphasen-isoelektrische Fokussierung (IEF) 12 ) und mit Immunoblotting nach Verdünnung im Laemmli-Puffer 13 verträglich Mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail 14 . <p class="jove_content" fo:keep-…

Discussion

Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Verwendung von flüssigem Stickstoff, um die Probe einzufrieren und das Mahlsystem zu kühlen. Die Verwendung von flüssigem Stickstoff verhindert biologischen Abbau und ermöglicht eine effiziente Pulverisierung, erfordert aber eine spezielle Schulung für eine sichere Handhabung.

In diesem Protokoll ist ein Schleifsystem für das Probenschleifen, da kleine Proben schwer von Standardmörtel und Stößeln zu erholen sind. In diesem Fall breite…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Das italienische Gesundheitsministerium unterstützte diese Studie (RC 2013-BIO 15). Wir danken Barbara Micheli für ihre hervorragende technische Unterstützung.

Materials

Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

参考文献

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?. Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).

Play Video

記事を引用
Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

View Video