Langfristige Live-Imaging von<em> Drosophila</em> Augen Disc
概要
Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.
Abstract
Live-Bildgebung bietet die Möglichkeit, kontinuierlich dynamische zelluläre und Entwicklungsprozesse in Echtzeit zu verfolgen. Drosophila Larven Imaginalscheibe verwendet wurden viele biologische Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Wachstum, Migration, Apoptose, Wettbewerb, Zell-Zell – Signalübertragung und compartmental Grenzbildung zu untersuchen. Allerdings Methoden für die langfristige ex vivo Kultur und die Bildgebung der Imaginalscheibe waren nicht zufriedenstellend, trotz vieler Anstrengungen. Vor kurzem haben wir ein Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung von Imaginalscheibe für bis zu 18 h. Neben eine hohe Insulinkonzentration in dem Kulturmedium zu verwenden, ein niedrigschmelzendes Agarose wurde auch einzubetten die Scheibe zu verhindern, dass es ein Abgleiten während des Abbildungsperiode verwendet. Dieser Bericht verwendet die Augen antennal Scheiben als Beispiel. Photorezeptor R3 / 4-spezifische mδ0.5 Ga4-Expression wurde gefolgt, dass der Photorezeptor differen zu demonstrierenzierung und Ommatidienrotation können während einer 10 h Live-Abbildungsperiode beobachtet werden. Dies ist ein detailliertes Protokoll diese einfache Methode beschreibt.
Introduction
Das Drosophila Larven Imaginalscheibe hat ein beliebtes Experimentiersystem für die Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Mechanismen gewesen. Diese Scheiben invaginieren aus dem embryonalen Epithel und werden sackartige Strukturen , die durch zwei Epithelschichten, Peripodial Epithelium (PE) und Disc Proper (DP) 1, 2 aufgebaut. Die Imaginalscheibe Zellen vermehren und schrittweise während der Larven- und Puppenstadien unterscheiden und schließlich in die adulten Körperstrukturen zu entwickeln. Durch die flache und einfache Zweischichtstruktur der Imaginalscheibe, sind sie leicht, wenn sie von Larven seziert zu beobachten. Doch trotz einiger Bemühungen von vielen Gruppen, die aktuellen Methoden für die langfristige Kultur der Imaginalscheibe sind nicht zufriedenstellend. Vor kurzem haben wir eine Kultur Methode entwickelt , die die normale Entwicklung von mehreren Imaginalscheibe für bis zu 18 Stunden aufrecht erhalten können und das erlaubt die Live – Darstellung 3 </sup>. Die Kulturverfahren können die Zelldifferenzierung und Migration unterstützen, aber es kann die Zellproliferation für nur 12.07 h unterstützt und kann nicht Disc Wachstum unterstützen. Der Hauptunterschied in dem Kulturmedium ist die hohe Konzentration von Insulin 3. Das Verfahren ist einfach, und keine spezielle Belüftung oder Mittelkreislauf erforderlich ist.
Eines der besten erforschten Imaginalscheibe ist der Blick antennal Scheibe. Das Drosophila Auge besteht aus etwa 800 Ommatidien aufgebaut. Jedes Ommatidium besteht aus acht Sehzellen (R1-R8). Im Larvenaugenscheibe unterscheiden die Sehzellen nach dem Durchgang der Morphogenetic Furche (MF), die über das Auge Scheibe von posterior nach anterior streicht 4, 5. Die Photorezeptoren in einer Ommatidium in Sequenz unterscheiden, mit R8 beginnen, gefolgt von R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 und R7 6. Die Ommatidien in den dorsalen und ventral Hälften der Auge Scheibe durchlaufen eine Drehung um 90 ° in entgegengesetzten Richtungen, was zu einer entgegengesetzten Chiralität 7, 8. Der Rotationsvorgang erfolgt in zwei Stufen: Zunächst wird eine 45 ° Drehung beginnt an und wird bei der sechsten Ommatidien Reihe hinter der MF beendet; die zweite 45 ° -Drehung wird bei etwa 16 Zeilen abgeschlossen 9, 10. Diese Studie Ommatidienrotation verwendet, gekennzeichnet durch die R3 / 4-spezifischen mδ0.5 Ga4-11, die normale Zelldifferenzierung und Dynamik zu demonstrieren , die durch diese Methode zur Kultur und Live-Bild , um das Auge Scheibe beobachtet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll für ein langfristiges Live – Imaging – Experiment auf Drosophila Imaginalscheibe. Wir haben viel Zeit, um die sorgfältige Präparation Üben Scheibenschäden zu vermeiden und für die Befestigung der Scheibe nahe der Deckgläser zu ermöglichen. Wir haben versucht, Poly-L-lysin (PLL) und niedrigschmelzender Agarose in das Gewebe zu halten; Am Ende zeigte die niedrigschmelzende Agarose eine bessere Fähigkeit, das Gewebe zu halten. Obwohl nur das Auge Scheibe in diesem Papier verwendet wurde, das normale Auftreten von Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation während der 10 h Live-Abbildungsperiode zu zeigen, kann dieses Verfahren auch auf mindestens eine anderen Scheibe aufgebracht werden, wobei die Flügelscheibe, wie in einem demonstrierte frühere Studie 3. Darüber hinaus ist das Kulturmedium Vorbereitung und Live-Imaging-Setup einfach und nicht Belüftung oder Mittelkreislauf erforderlich.
Kontinuierliche Echtzeit-Bildgebung kann eine klare zeitliche Abfolge von biologischem Vorabend bereitzustellennts. In unserem früheren Bericht von Glia – Differenzierung und Migration in die Augen Scheibe, wenn wir direkten Beweis dafür , dass Einwickeln Glia aus bestehenden Glia differenzieren nach an der Vorderseite des Auges Scheibe 3 migrieren. Langfristige ex vivo Kultur ermöglicht die gezielte Laser-aktivierte Markierung von Zellen, wie die Foto-Umwandlung des KAEDE fluoreszierenden Proteins, um ihr Verhalten 3 zu folgen. Es kann auch die Prüfung von Chemikalien aufnehmen, die direkt dem Kulturmedium zugegeben werden; Somit kann es als Wirkstoff-Screening-Plattform verwendet werden. Da einige dynamischer Prozess innerhalb von Minuten oder Sekunden auftreten, ist eine hohe zeitliche Auflösung erforderlich. Zur Verbesserung der zeitlichen Auflösung, Lichtblattmikroskopie 15, 16 oder Rotationsscheibenmikroskopie 17 kann eine gute Option sein.
Die aktuelle Kulturbedingung ist nicht perfekt. Dabei spielt es keine Scheibe Wachstum unterstützen. Zelle pRolltation wird nur bis zu 12 h unterstützt 3 . Nach 12 h in ex vivo- Kultur beginnt die Rate der Photorezeptor-Differenzierung 3 zu sinken. Dies kann auf den Mangel an bestimmten Nährstoffen oder Hormonen zurückzuführen sein. Da der Hauptunterschied in diesem Kulturmedium die hohe Konzentration an Insulin ist, kann das Säugetierinsulin teilweise die Funktion endogener Insulin-ähnlicher Peptide nachahmen. Die Zugabe von Fliegextrakt, der Insektenblutzucker Trehalose und verschiedene Konzentrationen des hämmernden Hormons 20-Hydroxyecdyson waren nicht vorteilhaft 3 . Allerdings reicht die 12-18 h Kulturperiode aus, um viele Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Alternative Kultivierungsmethoden für die Kultivierung von Larven-Imperialscheiben wurden verglichen 3 , und unsere Kultivierungs- und Imaging-Bedingung liefert das längste Zeitfenster und die meisten Klarheit für die Live-Bildgebung. Obwohl Scheiben in lebenden Larven und Puppen direkt abgebildet werden können18, 19, 20, 21, 22, die Auflösung und die Zeitfenster für die Beobachtungen sind begrenzt. Am späten Larven- und Puppen – Discs können für eine lange Zeit 23, 24, kultiviert werden , aber die Scheiben durchlaufen erhebliche Morphogenese. Um die Vorteile der flachen 2D Larvenscheiben zu nehmen, unsere Kultivierung und Abbildungsverfahren ist die beste Lösung so weit.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass Chun-lan Hsu und Yu-Chi Yang die Fliege Nahrung für die Vorbereitung und Pflege der Fliegen Aktien und zu Su-Ping Lee und das IMB-Imaging-Core für ihre Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, unterstützt MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) von der National Science Council und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Republik China.
Materials
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
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