Este protocolo describe un método detallado para el cultivo a largo plazo ex vivo y de formación de imágenes en vivo de un disco imaginal Drosophila. Esto demuestra la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial dentro del período de 10 horas de imágenes en vivo del ojo de disco. El protocolo es simple y no requiere instalación costosa.
Imágenes en vivo ofrece la posibilidad de rastrear continuamente los procesos celulares y de desarrollo dinámicos en tiempo real. Drosophila discos imaginales de larvas se han utilizado para estudiar muchos procesos biológicos, tales como la proliferación celular, la diferenciación, el crecimiento, la migración, la apoptosis, la competencia, la señalización célula-célula, y la formación de límite compartimental. Sin embargo, los métodos para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales no han sido satisfactorios, a pesar de muchos esfuerzos. Recientemente, hemos desarrollado un método para el cultivo a largo plazo ex vivo e imágenes en vivo de los discos imaginales para un máximo de 18 h. Además de utilizar una alta concentración de insulina en el medio de cultivo, una agarosa de bajo punto de fusión también se utilizó para incrustar el disco para evitar que la deriva durante el período de formación de imágenes. Este informe utiliza los discos ojo-antenal como un ejemplo. expresión mδ0.5-GA4 / 4-específica de fotorreceptores R3 se siguió para demostrar que fotorreceptor differenciación y rotación ommatidial pueden ser observados durante un período de formación de imágenes en vivo 10 h. Este es un protocolo detallado que describe este método simple.
Los discos imaginales de Drosophila larvas han sido un sistema experimental favorecido para el estudio de una amplia variedad de mecanismos biológicos. Estos discos se invaginan desde el epitelio embrionario y se convierten en estructuras en forma de saco como construido por dos capas epiteliales, peripodial Epitelio (PE) y el disco adecuada (DP) 1, 2. Las células del disco imaginal proliferan y se diferencian progresivamente durante las etapas de larva y pupa y eventualmente se convierten en las estructuras del cuerpo adulto. Debido a la estructura de dos capas plana y simple de los discos imaginales, que son fáciles de observar cuando disecados de larvas. Sin embargo, a pesar de varios esfuerzos de muchos grupos, los métodos actuales para el cultivo a largo plazo de los discos imaginales no han sido satisfactorios. Recientemente hemos desarrollado un método de cultivo que pueda sostener el desarrollo normal de múltiples discos imaginales para un máximo de 18 horas y que permite obtener imágenes en vivo 3 </sarriba>. El método de cultivo puede apoyar la diferenciación celular y la migración, pero que puede soportar la proliferación celular por sólo 7-12 h y no puede soportar el crecimiento del disco. La principal diferencia en el medio de cultivo es la alta concentración de insulina 3. El método es simple, y no se requiere aireación especial o circulación del medio.
Uno de los discos imaginales mejor estudiados es el ojo de disco-antenal. El ojo de Drosophila se construye de aproximadamente 800 ommatidia. Cada ommatidium se compone de ocho células fotorreceptoras (R1-R8). En el disco ojo larval, las células fotorreceptoras diferenciar siguiendo el paso de la morfogenética Surco (MF), que barre a través del disco ojo de posterior a anterior 4, 5. Los fotorreceptores en un ommatidium diferencian en secuencia, comenzando con R8, seguido por R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, y R7 6. El ommatidia en el dorsal y VEmitades ntral del disco ojo se someten a una rotación de 90 ° en direcciones opuestas, lo que resulta en quiralidad opuesta 7, 8. El proceso de rotación se produce en dos etapas: primero, una rotación de 45 ° comienza en y se completa en el sexto ommatidia fila detrás de la MF; la segunda rotación de 45 ° se completa en alrededor de fila 16 9, 10. Este estudio utilizó rotación ommatidial, marcado por el R3 / 4-específica mδ0.5-GA4 11, para demostrar la diferenciación celular normal y la dinámica que puede ser observado a través de este método a la cultura y vivir-imagen del disco ojo.
En este estudio, proporcionar un protocolo detallado para un experimento de imágenes en vivo a largo plazo en los discos imaginales de Drosophila. Pasamos mucho tiempo practicando la disección cuidadosa para evitar el daño del disco y para permitir la fijación del disco cerca de los cubreobjetos. Tratamos de poli-L-lisina (PLL) y bajo punto de fusión de agarosa para mantener el tejido; al final, la agarosa de bajo punto de fusión mostró una mejor capacidad para mantener el tejido. Aunque se usó sólo el ojo disco en el presente documento para demostrar la ocurrencia normal de la diferenciación de los fotorreceptores y la rotación ommatidial durante el período de formación de imágenes en vivo 10 h, este método también se puede aplicar a al menos otro disco, el disco del ala, como se demuestra en una 3 estudio previo. Por otra parte, la preparación de medio de cultivo y la configuración de imágenes en vivo son simples y no requieren aireación o circulación del medio.
imágenes en vivo continua puede proporcionar una clara secuencia temporal de la víspera biológicaNTS. En nuestro informe anterior de la diferenciación de células gliales y la migración en el ojo de disco, hemos proporcionado una prueba directa de que la glía envolver diferencian de glía existente después de migrar a la parte anterior del ojo disco 3. Cultivo a largo plazo ex vivo permite el etiquetado por láser activado específica de células, como la foto-conversión de la proteína fluorescente KAEDE, a seguir sus comportamientos 3. También puede acomodar el ensayo de productos químicos que se añaden directamente al medio de cultivo; Por lo tanto, se puede utilizar como una plataforma de cribado de fármacos. Dado que algunos proceso dinámico se produce en cuestión de minutos o segundos, se requiere una alta resolución temporal. Para mejorar la resolución temporal, microscopía de lámina de luz 15, 16 o girando la microscopía disco 17 puede ser una buena opción.
La condición de la cultura actual no es perfecto. No es compatible con el crecimiento del disco. p celularroliferation sólo se admite para un máximo de 12 h 3. Después de 12 h en cultivo ex vivo, la tasa de diferenciación de los fotorreceptores comienza a disminuir 3. Esto puede ser debido a la falta de ciertos nutrientes u hormonas. Dado que la principal diferencia en este medio de cultivo es la alta concentración de la insulina, la insulina de mamífero puede ser parcialmente imitando la función de los péptidos endógenos similares a la insulina. La adición de extracto de mosca, el insecto trehalosa azúcar en la sangre, y diversas concentraciones de la hormona de la muda 20 hidroxiecdisona, no fueron beneficiosos 3. Sin embargo, el periodo de cultivo de 12-18 h es suficiente para estudiar muchos procesos de desarrollo. Métodos de cultivo alternativos para el cultivo de discos imaginales larvas se han comparado 3, y nuestra condición de cultivo y de imagen proporciona la ventana de tiempo más largo y claridad para imágenes en vivo. Aunque los discos dentro de larvas vivas y pupas se pueden visualizar directamente18, 19, 20, 21, 22, la ventana de resolución y el tiempo para las observaciones son limitados. Late larvas y pupas discos pueden cultivarse durante mucho tiempo 23, 24, pero los discos se someten a la morfogénesis significativo. Para aprovechar las ventajas de los discos de larvas planas, 2D, nuestro método de cultivo y la imagen es la mejor solución hasta el momento.
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos a Chun-lan Hsu y Yu-Chi Yang para la preparación de la comida marcha y el mantenimiento de las poblaciones de moscas, y para Su-Ping Lee y el IMB Imaging Core por su ayuda con la microscopía confocal. Este estudio fue apoyado por becas a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102 a 2321-B-001 -002, MOST 103 a 2311-B-001 -035 -MY3) del Consejo Nacional de Ciencia y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de la República de China.
Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |