Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l'installazione costosa.
Immagini dal vivo offre la possibilità di monitorare continuamente i processi cellulari e dello sviluppo dinamico in tempo reale. Drosophila dischi imaginal larvali sono stati utilizzati per studiare molti processi biologici, quali la proliferazione cellulare, la differenziazione, la crescita, migrazione, apoptosi, concorrenza, segnalazione cellula-cellula, e la formazione confine compartimentale. Tuttavia, i metodi per il lungo termine ex vivo della cultura e immagini dal vivo dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti, nonostante i molti sforzi. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo per il lungo termine ex vivo la cultura e l'imaging dal vivo di dischi immaginali per un massimo di 18 ore. Oltre a utilizzare una concentrazione elevata di insulina nel mezzo di coltura, un agarosio bassofondente è stato utilizzato anche per incorporare il disco per evitare che deriva durante il periodo di imaging. Questo rapporto utilizza i dischi eye-antennomero come esempio. / 4-specifico espressione fotorecettore R3 mδ0.5-GA4 stata seguita per dimostrare che fotorecettore differenziazione e rotazione ommatidial possono essere osservati durante un periodo imaging dal vivo 10 h. Questo è un protocollo dettagliato descrive questo metodo semplice.
I Drosophila larvali dischi imaginali sono stati un sistema sperimentale favorita per lo studio di una grande varietà di meccanismi biologici. Questi dischi invaginate dall'epitelio embrionale e diventano strutture sac-come costruito da due strati epiteliali, Peripodial Epitelio (PE) e Disc Proper (DP) 1, 2. Le cellule disco imaginal proliferano e progressivamente differenziano durante gli stadi larvali e pupe ed eventualmente sviluppare nelle strutture corporee degli adulti. A causa della struttura a due strati piatta e semplice dei dischi imaginali, sono facili da osservare quando sezionato da larve. Tuttavia, nonostante molti sforzi da molti gruppi, i metodi attuali per la cultura a lungo termine dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti. Abbiamo recentemente messo a punto un metodo di coltura che può sostenere il normale sviluppo di molteplici dischi immaginali per un massimo di 18 ore e che permette l'imaging dal vivo 3 </sup>. Il metodo di coltura può supportare la differenziazione e migrazione cellulare, ma può sostenere la proliferazione cellulare solo per 7-12 ore e non può sostenere la crescita disco. La differenza principale nel mezzo di coltura è l'alta concentrazione di insulina 3. Il metodo è semplice, e non richiede alcun particolare aerazione o medio circolazione.
Uno dei dischi immaginali più studiato è il disco di eye-antenne. L'occhio di Drosophila è costruita di circa 800 ommatidi. Ogni ommatidium comprende otto fotorecettori (R1-R8). Nel disco occhio larvale, le cellule visive differenziare dopo il passaggio del Morfogenetica Solco (MF), che spazia attraverso il disco occhio da posteriore ad anteriore 4, 5. I fotorecettori in un ommatidium differenziano in sequenza, cominciando con R8, seguita da R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 e 6. L'ommatidi nella dorsale e vemetà ntral del disco dell'occhio subiscono una rotazione di 90 ° in senso opposto, con conseguente chiralità opposta 7, 8. Il processo di rotazione avviene in due fasi: in primo luogo, una rotazione di 45 ° inizia a ed è completato alla sesta fila ommatidi dietro la MF; la seconda rotazione di 45 ° si completa in circa 16 fila 9, 10. Questo studio ha utilizzato rotazione ommatidial, contrassegnata dalla R3 / 4-specifici mδ0.5-GA4 11, per dimostrare la differenziazione cellulare normale e dinamiche che possono essere osservati attraverso questo metodo di coltura e vivere immagine disco occhio.
In questo studio, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per un esperimento di imaging dal vivo a lungo termine su dischi immaginali Drosophila. Abbiamo passato un sacco di tempo praticando la dissezione attenta per evitare danni disco e per consentire il fissaggio del disco vicino alle lamelle. Abbiamo provato Poli-L-lisina (PLL) e basso punto di fusione agarosio per tenere il tessuto; Alla fine, l'agarosio a bassa fusione ha mostrato una migliore capacità di trattenere il tessuto. Anche se solo il disco occhio è stato utilizzato in questo documento per dimostrare la normale verificarsi di differenziazione dei fotorecettori e rotazione ommatidial durante il periodo in vivo imaging 10 h, questo metodo può essere applicato ad almeno un altro disco, il disco ala, come dimostrato in un studio precedente 3. Inoltre, la preparazione del mezzo di coltura e la configurazione di imaging in tempo reale sono semplici e non richiedono l'aerazione o medio circolazione.
Continuo immagini dal vivo in grado di fornire una chiara sequenza temporale di vigilia biologicanti. Nella nostra precedente relazione di differenziazione glia e la migrazione nel disco occhio, abbiamo fornito la prova diretta che glia avvolgenti differenziano dalla glia esistente dopo la migrazione a anteriore del disco occhio 3. A lungo termine ex vivo della cultura consente la specifica di etichettatura laser-attivata di cellule, come la foto-conversione della proteina fluorescente KAEDE, a seguire i loro comportamenti 3. Può ospitare anche la sperimentazione di sostanze chimiche che vengono aggiunti direttamente al mezzo di coltura; Quindi, può essere utilizzato come piattaforma di screening farmaco. Da qualche processo dinamico verifica entro minuti o secondi, è richiesta un'elevata risoluzione temporale. Per migliorare la risoluzione temporale, foglio microscopia ottica 15, 16 o filatura disco microscopia 17 può essere una buona opzione.
La condizione cultura attuale non è perfetta. Non supporta la crescita del disco. cellulare proliferation è supportata solo fino a 12 h 3. Dopo 12 ore in coltura ex vivo, il tasso di differenziazione dei fotorecettori inizia a diminuire 3. Ciò può essere dovuto alla mancanza di determinate sostanze nutritive o ormoni. Poiché la differenza principale in questo terreno di coltura è l'alta concentrazione di insulina, l'insulina mammiferi può essere parzialmente mimando la funzione di peptidi insulino-simile endogeni. L'aggiunta di estratto di volare, l'insetto trealosio di zucchero nel sangue, e varie concentrazioni dell'ormone muta 20-hydroxyecdysone, non erano favorevoli 3. Tuttavia, il periodo di coltura 12-18 h è sufficiente per studiare molti processi di sviluppo. Metodi di coltura alternativi per la coltura dischi immaginali larvali sono stati confrontati 3, e la nostra coltura e di imaging condizioni fornisce la finestra di tempo più lungo e più chiarezza per l'imaging dal vivo. Sebbene i dischi all'interno di larve vive e pupe possono essere esposte direttamente18, 19, 20, 21, 22, la finestra risoluzione e il tempo per le osservazioni sono limitate. Tardi larvale e dischi pupa possono essere coltivate per lungo tempo 23, 24, ma i dischi subiscono significativa morfogenesi. Per sfruttare le piane, dischi larvali 2D, il nostro metodo di coltura e di imaging è la soluzione migliore finora.
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a Chun-lan Hsu e Yu-Chi Yang per la preparazione del cibo mosca e il mantenimento delle scorte mosca, e Su-Ping Lee e l'IMB Imaging Nucleo per il loro aiuto con la microscopia confocale. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, PIÙ 103-2311-B-001 -035 -MY3) dal Consiglio nazionale della Scienza e il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Repubblica Popolare cinese.
Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |