הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em> דרוזופילה</em> דיסק העין
概要
פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.
Abstract
הדמית חיה מספקת את היכולת לעקוב אחר תהליכי הסלולר התפתחותי דינמיים ברציפות בזמן אמת. דיסקים דמותי תסיסנית זחל שמשו ללמוד תהליכים ביולוגיים רבים, כגון התפשטות תאים, בידול, צמיחה, הגירה, אפופטוזיס, תחרות, איתות בין תאים, ועל היווצרות גבול compartmental. עם זאת, שיטות התרבות לשעבר vivo לטווח ארוך הדמית חיה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון, למרות מאמצים רבים. לאחרונה, פיתחנו שיטה לטווח ארוך התרבות לשעבר vivo ו הדמיה חיה של דיסקים דמותי עד 18 h. בנוסף לשימוש בריכוז אינסולין גבוה בטווח הבינוני התרבות, agarose התכה נמוכה שמש גם כדי להטביע את הדיסק כדי למנוע ממנו נסחף בתקופת ההדמיה. הדוח משתמש דיסקים-מחושי העין כדוגמא. קולטי האור R3 / 4 ספציפי ביטוי mδ0.5-Ga4 בעקבות מנת להוכיח כי קולטי אור בידולtiation וסיבוב ommatidial ניתן לראות בתקופת הדמיה 10 h חי. זהו פרוטוקול מפורט המתאר שיטה פשוטה זו.
Introduction
הדיסקים דמותי הזחל תסיסנית כבר מערכת ניסיונית המועדף לחקר מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים. דיסקים אלו invaginate מן האפיתל העוברי ולהיות צק דמוי מבנים שנבנו על ידי שתי שכבות אפיתל, האפיתל Peripodial (PE) ו דיסק פרופר (DP) 1, 2. תאי הדיסק דמותי להתרבות בהדרגה להבדיל בשלבי זחל גלמים ובסופו של דבר לפתח לתוך המבנים בגוף הבוגר. בשל המבנה דו השכבתי השטוח ופשוט של הדיסקים דמותי, הם קלים להתבונן כאשר גזורים מן הזחלים. עם זאת, למרות כמה מאמצים על ידי קבוצות רבות, את השיטות קיימות בתרבות לטווח הארוכה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון. פתחנו לאחרונה שיטת תרבות שיכולה לתמוך בהתפתחות התקינה של דיסקים דמותי מרובים עבור עד 18 שעות ולאחר המאפשר הדמית חיה 3 </sעד>. שיטת התרבות יכולה לתמוך התמיינות תאי הגירה, אבל זה יכול לתמוך שגשוג תאים רק 7-12 h ולא יכול לתמוך בצמיחת דיסק. ההבדל העיקרי במדיום התרבות הוא הריכוז הגבוה של אינסולין 3. השיטה היא פשוטה, ולא אורור מיוחד או במחזור בינוני נדרש.
אחד הדיסקים דמותי הנחקרים ביותר הוא דיסק מחושים-העין. עין תסיסנית בנויה של כ 800 האומטידיה. כל אומטידיום מורכב משמונה תאי קולטי אור (R1-R8). בשנת דיסק עין הזחל, תאי קולטי האור בהבחנה בעקבות המעבר של התלם המוךפו"גנטי שהולך (MF), אשר חולף על פני דיסק העין מן אחורי אל קדמי 4, 5. קולטני האור בתוך האומטידיום להבדיל ברצף, החל R8, ואחריו R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, ו R7 6. האומטידיה הגבה ו veחצאים ntral של דיסק העין לעבור סיבוב 90 מעלות בכיוונים מנוגדים, ותוצאת כירליות היפך 7, 8. תהליך הסיבוב מתרחש בשני שלבים: ראשון, סיבוב 45 ° מתחיל ומסתיים בשעה בשורת האומטידיה השישית מאחורי MF; הסיבוב השני 45 ° הושלם בסביבות שורה 16 9, 10. מחקר זה השתמש ברוטציה ommatidial, בסימן R3 / 4 ספציפי mδ0.5-Ga4 11, כדי להדגים את התמיינות תאים נורמליים ואת הדינמיקה שניתן לצפות באמצעות שיטה זו לתרבות ולחיות הדימוי הדיסק העין.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור ניסוי הדמית חיה ארוך טווח על דיסקים דמותי דרוזופילה. בילינו הרבה זמן לתרגל את דיסקציה זהירה כדי למנוע נזק דיסק וכדי לאפשר את הקובץ המצורף של הדיסק קרוב coverslips. ניסינו פולי- L- ליזין (PLL) ו-התכה נמוכה agarose להחזיק את הרקמה; בסופו של דבר, את agarose-התכה נמוכה הראו יכולת טובה יותר להחזיק את הרקמה. אמנם רק את דיסק עין משמש במאמר זה כדי להדגים את ההתרחשות הנורמלית של בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial במהלך 10 תקופת הדמית h חייה, שיטה זו יכולה לחול גם על אחד לפחות דיסק אחר, דיסק האגף, כפי שהנה באה לידי הביטוי מחקר 3 קודם. יתר על כן, הכנת בינוני תרבות התקנת הדמית חיה פשוטה ואינה דורשת אוורור או במחזור בינוני.
הדמית חיה רציפה יכולה לספק רצף זמני ברור של ערב ביולוגיNTS. בדו"ח הקודם שלנו של בידול גליה והגירה בתוך דיסק העין, ספקנו הוכחה ישירה כי גליה גלישה להבדיל מן גליה קיימת לאחר הגירה אל הקדמי של דיסק העין 3. תרבות vivo לשעבר לטווח ארוך מאפשרת תיוג הליזר מופעל הספציפי של תאים, כגון מרת התמונה של חלבון פלואורסצנטי לקאךה, כדי לעקוב אחרי התנהגותם 3. זה גם יכול להכיל את הבדיקה של כימיקלים שנוספים ישירות מדיום התרבות; ובכך, ניתן להשתמש בה כפלטפורמת הקרנת סמים. מאחר שחלק תהליך דינמי להתרחש בתוך דקות או שניות, ברזולוציה גבוהה זמנית נדרשה. כדי לשפר את הרזולוציה הזמנית, מיקרוסקופיה גיליון אור 15, 16 או ספינינג דיסק מיקרוסקופיה 17 עשוי להיות אפשרות טובה.
תנאי התרבות הנוכחי אינו מושלם. היא אינה תומכת צמיחה דיסק. תא proliferation נתמך רק עד 12 h 3. אחרי 12 h בתרבות vivo לשעבר, שיעור בידול קולטי האור מתחיל לרדת 3. זה יכול להיות בגלל חוסר הזנה או הורמונים מסוימים. מאז ההבדל העיקרי במדיום התרבות זו הוא הריכוז הגבוה של אינסולין, האינסולין היונק עלול להיות חלקי מחק את הפונקציה של פפטידים דמוי אינסולין אנדוגני. התוספת של תמצית זבוב, trehalose הסוכר בדם החרקים, וריכוז שונה של הורמון ההנשרה 20-hydroxyecdysone, לא הייתה מועילה 3. עם זאת, תקופת תרבות 12-18 h מספיקה כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים רבים. שיטות culturing אלטרנטיביות עבור culturing דיסקים דמותי זחל כבר לעומת 3, ומצבו culturing ודימות שלנו מספק את חלון הזמן הארוך ביותר והבהיר ביותר עבור הדמיה חיה. למרות דיסקים בתוך זחלים וגלמים חיה ניתן הדמיה ישירות18, 19, 20, 21, 22, חלון הרזולוציה וזמן לתצפיות מוגבלים. זחל מאוחר דיסקים גלמי יכולים להיות מתורבתים במשך זמן רב 23, 24, אך הדיסקים עוברים morphogenesis המשמעותי. כדי לנצל את הדיסקים השטוחים, 2D זחל, שיטת culturing ודימות שלנו היא הפתרון הטוב ביותר עד כה.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים צ'ון-יאן הסו יו-צ'י יאנג להכנת אוכל לטוס ושמירה על מניות זבוב, וכדי סו-פינג לי ואת Core הדמיה IMB עזרתם עם מיקרוסקופיה confocal. מחקר זה מומן על ידי מענקים YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, רוב 103-2311-B-001 -035 -MY3) מהמועצה הלאומית למדע ומשרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה של סין.
Materials
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
参考文献
- Cohen, S. M., Bate, M., Martinez-Arias, A. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. 2, 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. . The Development of Drosophila Melanogaster. , 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, ., Wittbrodt, F., J, E. H., Stelzer, Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D’Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
