我们描述了一种新的实验技术, 我们称之为微创肌肉植入 (MIME), 这是基于证据表明, 骨骼肌肉组织含有可行的肌细胞, 可以促进捐赠细胞介导的肌时, 注入一个宿主肌肉。
骨骼肌具有再生能力, 由于组织驻留, 肌肉纤维生成 (肌) 卫星细胞 (SCs), 可以形成新的肌肉纤维在适当的条件。虽然 SCs 可以从肌肉组织和培养的体外, 产生的肌细胞在促进肌移植到宿主肌肉时并不十分有效。手术暴露的宿主肌肉和移植部分的捐赠肌肉组织, 或独立的肌肉纤维与他们的 SCs 到主机肌肉, 促进更好的肌相比, 肌移植。我们开发了一种新的技术, 我们称之为微创肌肉植入 (MIME)。哑剧包括通过一根外科针通过宿主肌肉, 通过针迹来绘制捐献者的肌肉组织, 然后将捐献者的组织植入宿主的肌肉中, 这样它就可以充当宿主肌肉的 SCs 的来源。在这里, 我们详细描述了在缺陷鼠标模型中执行 MIME 所涉及的步骤, 它在所有的细胞中表达绿色荧光蛋白 (GFP)。宿主小鼠的免疫缺陷降低了供体组织免疫排斥的风险, 而 gfp 表达可以方便地识别宿主肌纤维 (gfp +) 和供体细胞来源的肌纤维 (gfp)。我们的试验数据表明, MIME 可以用来植入一个伸肌腱长长 (EDL) 肌肉从一个供鼠到胫骨前 (TA) 肌肉的宿主鼠标。我们的数据还表明, 当 myotoxin (氯化钡, 氯化2) 被注射到宿主肌肉后, MIME, 有证据表明, 捐赠细胞衍生的肌在主机的肌肉, 约 5%, 26%, 26% 和43% 的纤维在一个单一的主机 TA肌肉显示没有主机的贡献, 最低的主机贡献, 适度的主机贡献, 和最大的主机贡献, 分别。
健康的骨骼肌肉, 即使有丝分裂, 具有优良的再生能力, 由于存在组织驻留的肌细胞 (SCs)1,2;并在3,4中进行了审阅。然而, 在肌肉营养, 创伤或加速老化引起的病理条件下, 肌肉的再生可能与肌肉破裂不匹配, 因此, 渐进性肌纤维丢失发生在5。虽然已经开发出有效的方法来分离肌肉中的 SCs 和扩大他们的文化, 以产生大量的成肌细胞 (和随后管), 试图产生生理相关的肌肉纤维在主机肌肉有仅取得了最小的成功6。与许多其他细胞类型一样, 当成肌细胞被单独注射到宿主组织中时, 大多数单元格不嫁接7,8。我们已经表明, 神经肌肉电刺激 (NMES) 促进供体细胞衍生肌在再生不足的宿主小鼠肌肉注射与人成肌细胞8。其他人已经证明, 手术移植的活检肌或单肌纤维与连接的 scs, 促进适度肌即使没有 NMES, 建议植入全肌纤维与 scs 可能比植入更有利单肌细胞9,10。由于移植到宿主肌肉中的供体或工程化肌肉组织产生的结果比单独移栽细胞的效果好, 所以组织或组织样结构可能为供体细胞植入提供关键的线索;一个概念, 这是越来越明显的细胞治疗研究涉及各种细胞类型10,11,12。
最近的数据表明, 从人类获得的 SCs 超过2周后宰后生成管在文化13。因此, 我们打算评估, 如果植入的肌肉组织被收割后的活体主机将扭转肌肉纤维的损失。我们开发了一种新的技术叫哑剧, 将捐献者的肌肉组织植入活寄主的骨骼肌组织中, 以促进供体细胞衍生的肌。哑剧包括通过一根外科针通过宿主肌肉来创建一个针迹;通过针迹绘制一小段供体肌肉组织;将供体组织留在宿主肌肉中;用纸巾把针孔关上在其他实验中进行的安乐死小鼠的技术练习后, 我们已经在缺陷和无所不在表达绿色荧光蛋白 (GFP) 的活鼠中进行了哑剧, 并在3和14天后随访。在3天后的 MIME, 我们确认, 捐赠鼠 (gfp) EDL 肌肉植入宿主鼠 (gfp +) TA 肌肉, 仍然嵌入在主机肌肉。在14天后的 MIME, 在氯化2 myotoxin 损伤引起损伤和肌后, 我们确认在单个主机 TA 肌肉中, 大约5%、26%、26% 和43% 的纤维显示没有主机贡献, 最小主机贡献, 适度主机贡献, 和最大的主机贡献, 分别。在 myotoxin 注射后的大约95% 的 TA 肌纤维中, 出现了中央核化 (退化和随后再生的标志)。
我们研究的 TA 肌肉14天后, MIME + 氯化2 , 因为这个时间点捕捉再生的中间阶段, 当大多数再生纤维是中央有核的。我们研究 GFP + 小鼠作为宿主的哑剧, 因此, 当我们最终移植到宿主鼠的尸体肌肉, 我们将能够很容易地区分寄主和捐献者的肌肉纤维。我们使用鼠 EDL 肌肉作为实验性的供体组织, 因为从这个肌肉的单纤维显示出比 TA 肌肉更大的肌电位9。EDL 肌肉也与 TA 肌肉协同, 具有类似的纤维型成分。我们的初步数据表明, MIME 能够促进宿主肌肉中供体细胞衍生的肌。
在这里, 我们提出了一个详细的协议为新的实验技术称为哑剧, 开发在我们的实验室, 以植入供体肌肉组织的宿主肌肉组织。这是一个开放的肌肉移植技术的适应, 已经证明是有效的促进捐赠细胞介导的肌在主机肌肉9,10,17。
哑剧的目的是不使植入的捐赠肌肉组织本身的宿主肌肉 (我们目前不知道是否发生这种情况), 而是提供一个来源的 SCs, 可以促进肌在宿主肌肉的条件下, 刺激 muscle 再生。我们希望, 在基础和临床前研究中对 MIME 进行了优化和测试后, 它可以提供有价值的洞察力, 指导临床治疗, 以增加骨骼肌的肌肉再生, 这已经经历了肌力肌肉的丧失。
关于如何将 MIME 转化为临床治疗, 我们还有许多问题有待回答, 例如: 我们如何控制捐赠组织的质量?我们如何控制捐赠组织和细胞的免疫排斥?捐献的组织在为肌提供细胞后是否被清除, 还是留下了纤维化的疤痕?纤维类型的供体和/或宿主肌肉影响捐赠细胞介导的肌?哪些肌肉能从哑剧中获益?我们目前正在扩大我们的研究, 以评估是否 MIME 是安全和有效的, 找出辅助治疗, 可以增加捐助者派生的肌, 并回答上述的许多问题。
在完成我们的测试 mouse-to-mouse 异体移植与哑剧, 我们下一步是执行 human-to-mouse 的哑剧与尸体人体组织, 以评估的肌源性潜力的尸体肌肉组织。我们预计, 这些实验将导致一个新的基础和转化研究, 其中包括来自捐赠者的肌肉组织, 谁是注册的倡议, 如身体遗赠计划的教育和生命的礼物计划捐赠器官.
这份手稿中的代表性数据表明, 在14天后的 MIME, 有几个可行的纤维, 要么缺乏 gfp 或低含量的 gfp。我们对这些数据的解释是, GFP-施主卫星细胞促成了宿主肌肉中的肌。我们进行了这项实验, 准备将人类尸体组织植入宿主鼠的肌肉中。为了明确地证明, 捐献的卫星细胞在肌后的宿主肌肉中起到了促进作用, 因此, 植入表达荧光报告的捐献组织是很有用的, 它可以很容易地与 GFP 区别开来 (例如,红色荧光蛋白, 表达供体组织植入 GFP + 宿主肌)。
这种技术主要是受捐赠组织中的 SCs 的性质的限制。如果供体组织中的 SCs 是可行的, 该技术很可能促进供体细胞介导的肌, 而如果它们不可行, 肌就无法发生。然而, 由于 SCs 是非常有弹性的, 并且在大约2周后是可行的, 因此很有可能是为了实验目的, 在收获后几分钟内植入的捐赠组织将促进供体细胞介导的肌13.此外, 如上所述, 这是可能的, 因为整个肌肉组织 (包括 SCs, 成熟的肌肉纤维, 以及肌肉驻留成纤维细胞) 嵌入到宿主肌肉, 纤维化可能发生。然而, 这一假设需要经过实证检验。关于损伤性收缩、冷冻和实验 myotoxins 所引起的肌肉损害的文献表明, 免疫细胞 (主要是噬细胞) 能够有效地清除受损纤维中的细胞碎片并重塑胞外基质18。因此, 在 MIME 和氯化2注入后, 只要宿主免疫细胞能够接触到退化的供肌纤维, 它们就可以清除碎片, 只留下捐献者 SCs。最后, 供体来源的肌的程度取决于在宿主肌肉中嵌入的供体肌肉组织的数量。为了使宿主肌室完全重新由供体细胞衍生的纤维, 它需要一个方法, 如 X 或伽玛辐照蚀主机肌肉 SCs, 也需要重复的 MIME 程序。
已经证明, 手术暴露的主机肌肉和缝合一块捐赠组织的主机肌肉可以促进捐赠细胞介导的肌9,10,17。这种开放式的手术方法已经被用来追踪肌的进展, 并产生人类肌肉疾病的小鼠模型。MIME 技术的创新之处在于它是微创的, 不涉及手术暴露宿主肌肉。这降低了医源性感染的风险和宿主动物的不适程度, 因此, 如果需要的话, 在同一宿主肌肉上重复执行 MIME 更可行。
我们预计, MIME 技术可能是一个适当的细化, 开放的手术方法, 目前正在采取的植入供体肌肉组织的宿主鼠标。通过在宿主小鼠肌肉中嵌入活检的人的肌肉, 这可以加快产生人性化的小鼠模型。此外, 根据我们的初步数据从 mouse-to-mouse 嫁接, 我们预计, MIME 将是有效的, 以获得捐助者细胞介导的肌从人类尸体捐献组织, 只要捐助者 SCs 是可行的。最后, 通过额外的测试和验证, 我们希望, MIME 技术将有助于开发新的疗法, 以促进供体细胞介导的肌在人类肌肉疾病。
成功的 MIME 技术是关键依赖于准确地嵌入的捐赠组织在筋膜室 (epimysium) 的主机肌肉。只有当捐献者的组织被放置在寄主的肌肉舱内, 它才能够以精确的方式向宿主肌肉提供 SCs。如果捐献者的组织被放置在宿主肌肉之外, 那么它的命运还不清楚。在我们的哑剧实验模型中, 我们使用 TA 肌肉作为宿主肌肉, 因为它是突出的, 表面上放置在腿的前外侧。ta 肌肉的大小, 方向和解剖位置, 使它很容易证实, 捐赠组织是正确地放置在主机 ta 肌肉后哑剧。在本文中, 我们提供了实验证据, 供体组织 re在主机 TA 肌肉内嵌入的电源在3天后, 哑剧, 并有捐助者细胞介导的肌在主机肌肉在14天后, 哑剧。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由一个试点赠款, 从联盟的再生康复研究和培训 (AR3T) 和教员启动包从韦恩州立大学到 JAR。AR3T 由国家儿童健康和人类发展研究所 (研究院)、国家神经紊乱和中风研究所 (一) 和国家生物医学成像和生物工程研究所 (NIBIB) 支持。) 的国家卫生研究院奖编号 P2CHD086843。内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
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Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |