전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

인간의 종양 계약 프랑스 윤리 위원회의 및 프랑스 법률의 기사 L.1121-1 응용 프로그램에서 지원 Publique-Hôpitaux 드 파리 (AP-HP)에 의해 얻은 했다. 서 면된 통지 해준 동의 연구에 포함 하기 전에 환자 로부터 얻은 것입니다. 1. 인간의 폐 종양을 얻기 그들의 폐 종양4의 완전 한 외과 절제술 수술 단계-III 비 작은 세포 폐암 환자에서 신선한 폐 종양 샘플을 가져옵니다. 얼음 처럼 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI 1640) 매체를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 고정 되지 않은 신선한 종양을 전송 합니다. 2.7 단계까지 30 분 동안 얼음에 따로 설정 합니다.참고: 종양은 오후에 받으면 넣어 하룻밤에 4 ° C 및 프로세스는 다음 날에. 이 경우 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 RPMI 1640 미디어 보충. 2. Agarose 포함 하 고 vibratome 인간의 폐 종양의 슬라이스 참고: 무 균 조건 하에서 2.10까지 모든 단계를 수행 합니다. 1 g 낮은 녹는 포인트 agarose 인산 버퍼 (PBS) 염 칼슘 및 마그네슘의 살 균 20 mL에 용 해 하 여 포함 5 %agarose 솔루션을 준비 합니다. 이 솔루션을 마이크로파는 agarose는 완전히 녹아 때까지. 37 ° C에서 37 ° C에서 5 분 동안 인큐베이터에 솔루션을 배치 하 여 냉각 agarose를 허용 합니다. 조직 문화 후드, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 4 m m L 글루타민 그리고 페니실린과 스 x 1 (페 놀 레드) 없이 완전 한 RPMI 1640 매체를 준비 합니다. 6 잘 셀 문화 접시에 잘 당 1.1 mL 전체 RPMI 1640 매체를 추가 하 고 각 우물에서 30 mm 셀 문화 삽입 장소. 정해 접시 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 단계 2.12까지. 장소는 35 m m 플라스틱 접시 가득 RPMI 완전 한 매체에에서 스테인리스 플랫 와셔 (내경 5 mm, 10 mm의 직경 및 두께 1 mm의 외부의)을 멸 균. 와셔는 vibratome 컷 슬라이스에 항 체를 집중을 더 사용 됩니다. 10 cm 플라스틱 접시에 종양 생 검을 놓고 약 5 x 5 m m 길이의 작은 큐브 모양 조각으로 날카로운 블레이드와 종양을 잘라. 인큐베이터에서 agarose를 꺼내와 35 m m 플라스틱 그릇에 솔루션을 붓는 다. 집게의 쌍을 사용 하 여 신중 하 게 매체의 초과 제거 하는 조직 없애 종양 조각을 전송. agarose 조각을 삽입 하 고 플라스틱 접시의 바닥에 그들을 배치. Agarose 젤을 강화 하기 위해 5 분 동안 얼음에 둡니다. 일단는 agarose 굳은 플라스틱 접시를 반전 하 고 전체 젤을 주걱을 사용 하 여. 날카로운 블레이드를 사용 하 여 주변 조직 주위 젤의 3-5 m m를 떠나는 종양 조각 초과 agarose 트림. 비-독성 부 틸 cyanoacrylate 조직 접착제의 방울으로는 vibratome의 견본 디스크에 각 agarose 블록을 탑재 합니다. 살 균 얼음 처럼 차가운 PBS를 가진 vibratome 버퍼 트레이 표본 디스크 트레이에 설치. 잘라내기는 agarose 350 µ m 두꺼운 조각으로 조직 포함. Vibratome 설정을 느린 범위 속도 조정 (0.2-0.3 m m/s)와 진동 주파수는 중간 범위 (1.5 m m)에서. 절단 되 고 6 잘 플레이트 (2.3 단계)의 셀 문화 삽입에 평평 넣어 종양 조각 수집 신중 하 게 미세 집게를 사용 하 여. 1 조각에 각 삽입 전송. 주의 사용 하 여 쉽게 파손 될 수 있으므로 분할 영역을 처리할 때. 미세 집게를 사용 하 여 각 개별 슬라이스에 스테인레스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔 종양 조직을 둘러싼 agarose 잘 배치는 다는 것을 확인 하십시오. 5% CO2 습도 인큐베이터 immunostaining 10 분 진행에 대 한에서 37 ° C에서 문화 접시를 유지 합니다. 3. 거주 CD8 T 세포와 종양 세포의 Immunostaining 항 체 (최종 농도 10 µ g/mL)와 RPMI 1640 미디어 페 놀 레드 없이 핵 염료 (최종 농도 1 µ g/mL)을 희석.참고: 사용 붙일 결합 안티-CD8 (murine IgG SK1 복제) 및 안티-EpCAM (상피 세포 접착 분자) (murine IgG 좋음-125) 레이블을 CD8 T 세포 및 종양, 상피 세포 각각에 항 체. 레이블 섬유 아 세포와 활성화 된 내 피 세포 항 체 붙일 결합 안티-CD90/Thy1 (murine IgG, 클론 5E10)를 사용 합니다. 사용 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 조직 생존 능력을 평가 하기 위해 손상 된 원형질 막 세포의 핵을. 인큐베이터에서 배양 배지를 제거 하 고 스테인레스 스틸 와셔 내부 액체를 발음 하는 피 펫을 사용 하 여. 1.1 mL RPMI 1640 미디어 셀 문화 삽입 (2.3 단계) 아래에 배치 제거 하지 마십시오. 슬라이스를 만지기 없이 피 펫 팁을 사용 하 여 각 종양 조각에 항 체를 포함 하는 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 항 체 얼룩이 지기 수 있도록 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어. 좋은 집게, 와셔를 제거, 조각, 및 딥 그들 10의 RPMI 1640 미디어 페 놀 레드 없이 밖으로 데리고. 다시 셀 문화 삽입에 분할 영역을 배치 하 고 페 놀 레드 무료 RPMI-1640의 한 방울을 추가 각 개별 슬라이스에 중간. 이미징에 37 ° C 10 분 진행에서 접시를 유지 합니다. 4. 상상 하 고 인간 폐 종양 조각 내 거주 CD8 T 세포 마이그레이션 분석 참고:이 프로토콜에서 사용 하는 confocal 현미경은 물 침수 목표 x 25를 장착 하는 디스크를 회전 하는 직 립 (25 x / 0.95 없음). 현미경 설치 준비 이미징 세션을 시작 하기 전에 몇 시간 37 ° C에서 현미경 열 챔버의 온도 설정 합니다. 설정 시스템을 지속적으로 perfuse와 종양 조각 산소 (5% CO2, 95% O2) 페 놀 레드 무료 RPMI 매체 (그림 1). 연동 펌프를 사용 하 여 이미징 챔버로 관류 미디어 흐름 쓰레기 플라스 크에 대 한 해결책을 발음. 관류 튜브를 통해가 서 산소 솔루션 수 있도록 연동 펌프를 실행 합니다. 좋은 집게와 6 잘 플레이트 및 전송 35 m m 플라스틱 접시를 가득 페 놀 레드 무료 RPMI 매체에서 슬라이스를 꺼내. 2 mm 간격 스레드 19.7 m m 직경 슬라이스 앵커와 슬라이스 무력화 현미경의 이미징 단계에 페 트리 접시를 놓습니다. 관류 시스템의 입구 및 출구 팁을 연결 합니다. 켜고 관류 시스템 0.8 mL/min로 미디어 흐름 속도 설정 합니다. 물 침수 목표는 슬라이스를 낮춥니다. 밝은 분야 빛 조각 위에 초점.적절 한 형광등을 사용 하 여, CD8 T 세포, 종양 독도 (EpCAM 양수)와 기질 (CD90 양수)를 포함 하는 관심의 영역을 선택 합니다. 조직에 DAPI 잘라 표면에 얼룩과 깊이 평가 하 여 슬라이스 내의 세포의 생존 능력을 확인 합니다.참고: 건강 한 조각 잘라 표면에서 몇 미크론에서 DAPI 긍정적인 세포의 단지 소수 민족을 포함합니다. 다음 작업으로 이미징 세션을 설정 합니다. 3 fluorophores의 형광 신호 강도 따라 20 ~ 40% 사이 레이저 강도 50 ~ 800 ms 사이의 노출 시간을 설정 합니다. Z 스택 두께 종양 조각 내에서 이미지를 선택 합니다.참고: 여기, 10-12 광 평면 z 차원에서 60-70 µ m의 총 깊이 확장 했다 점령. 첫 번째 레이블이 CD8 T 세포 아래 약 10 µ m에서 시작 위치를 선택 합니다. 10 ~ 30 사이 각 z 스택 이미지 사이의 시간 간격을 정의 s와 10 ~ 30 분 사이 총 녹화 시간. 참조4에 설명 된 대로 주민 CD8 T 세포 마이그레이션 분석. 추적 소프트웨어를 데이터를 가져온 후 필드에 각 CD8 T 세포에 대 한 관광 명소를 만듭니다. 셀의 직경 및 탐지 군데 형광 세포에 따라 임계값을 조정 합니다. 트랙을 검사 하 고 그들을 삭제 하 여 무관 한 트랙을 제거 합니다. 연결 하 고 다른 트랙과 같은 트랙의 다른 시간 점에 분리 하 여 올바른 추적 합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 (트랙 속도, 트랙 변위 길이) 데이터를 내보냅니다.