本协议描述了一种图像驻留肿瘤浸润 CD8 T 细胞标记的人肺肿瘤切片荧光耦合抗体的方法。这项技术允许 real-time 分析 CD8 T 细胞迁移使用共聚焦显微镜。
CD8 T 细胞是对抗癌症的关键人物。为了使 CD8 T 细胞杀死肿瘤细胞, 他们需要进入肿瘤, 在肿瘤微环境中迁移, 并对肿瘤抗原作出适当反应。最近发展的改进成像方法, 如2光子显微镜, 和使用强大的小鼠肿瘤模型已经揭示了一些机制, 调节抗肿瘤 T 细胞的活动。虽然这些系统提供了宝贵的洞察力, 但它们并不总能预测人类的反应。在人类方面, 我们在这一领域的知识主要来自于对人类患者的固定肿瘤样本的描述, 以及体外研究。然而,体外模型缺乏复杂的三维肿瘤环境, 因此, 是体内T 细胞活动的不完全近似。由说明组织制成的新鲜切片代表了一个复杂的多肿瘤环境, 可以作为共研究和动物模型之间的重要联系。最初设置在小鼠淋巴结1 , 以前在朱庇特文章2中描述, 这种方法现在已被转化为人类肿瘤, 以检查两个镀膜的动力学3以及驻留 T 细胞4。
本文介绍了一种用于制备人肺肿瘤切片、免疫 CD8 t 和肿瘤细胞的方法, 以及利用共聚焦显微镜对肿瘤微环境中 CD8 t 淋巴细胞进行追踪的协议。该系统是唯一的放置在屏幕上的新的免疫治疗药物, 有利于 T 细胞迁移肿瘤。
CD8 T 细胞在抗癌的斗争中起着关键作用。然而, 许多抑制机制阻止 T 淋巴细胞杀死恶性细胞。在过去的几年中, 一些有希望的策略, 释放刹车的 T 细胞已经开发和使用的诊所5。保留相当注意的两种方法是免疫检查点靶向抗体, 如 anti-PD-1 和过继 T 细胞疗法。然而, 尽管最近取得了成功, 但只有一部分患者受益于这些疗法6。一个主要的挑战是找出抗肿瘤免疫疗法的机制, 以便开发更有效的治疗方法。另一项挑战是开发模型系统, 使新的治疗方法的特点和测试, 其效力和安全性。 到目前为止, 大多数的这些化验都是基于体外细胞培养系统, 它不太能模仿肿瘤组织的复杂性。
前体组织切片是一种很有前途的技术, 因为它保留了原始的组织微环境7。多年来, 我们建立了这种方法来跟踪各种组织中 T 淋巴细胞的动态变化。我们的结果表明, 荧光标记 T 细胞添加到小鼠的淋巴结切片迁移到组织, 并响应其适当的微提示1,2。 同样, 在人肺肿瘤切片上的 T 淋巴细胞被迅速吸收到肿瘤基质中3。利用这一技术, 我们确定了细胞外基质作为控制人类肿瘤 T 细胞分布和迁移的一个重要因素3,4。由于体外纯化和镀膜 t 细胞的行为并不一定反映了居民瘤 t 淋巴细胞的行为, 我们最近改进了这种方法 4。
在这里, 我们描述了一个协议, 以跟踪居民 T 淋巴细胞的切片由新鲜人的肺部肿瘤。不同的步骤包括制备人肺肿瘤切片 (包括琼脂糖嵌入和 vibratome 切片的嵌入组织), 在新鲜的肿瘤切片内源性 T 细胞的荧光抗体染色, 并监测这些细胞与共聚焦显微镜。
本文介绍了一种直接、快速、稳健的人肺肿瘤切片技术, 并利用共焦显微镜对保存在肿瘤环境中的 CD8 T 细胞的动态行为进行了评价。这个协议是一个以前的朱庇特文章的细化, 描述了对小鼠的淋巴结切片2监测的镀 T 细胞。
荧光染料的漂白必须特别考虑第一代染料, 如荧光素异硫氰酸酯和藻。我们发现在双光子显微镜下, 直接耦合的抗体有明显的漂白。与此相反, 最小的漂白被发现与共聚焦显微镜, 特别是使用明亮的荧光染料最近开发。
抗体是相对较大的分子, 因此它们渗透到组织中可能是困难的。这一步可以提高孵化时间。此外, 使用更小的染色试剂, 如直接耦合的抗体片段, 是一种很好的替代品。
本协议中描述的所有抗体都已经过验证, 并且已知可以产生明亮的着色4。因此, 不需要同种控件。然而, 如果对这种方法的修改使用其他抗体是需要的, 那么使用同种控制抗体是极力推荐的。
这一实验系统有一定的局限性。切割过程将损害组织, 这可能会影响 CD8 T 细胞的行为, 特别是在切割表面附近。此外, 一些可溶性因素 (如趋化因子) 有助于控制 T 细胞的迁移, 可以失去。绕过这些问题的一种方法是, 通过监测位于组织的大概更健康区域的表面上几十微米的 T 细胞。已发表的实验表明, 在组织内深部的 t 细胞的迁移比在切口表面附近的 t 细胞更活跃.4。我们已经用共焦显微镜进行了研究, 但有可能是双光子显微镜将增加空间分辨率的深度。
这种方法依赖于非中性分子的荧光耦合抗体的使用。全尺寸抗体易受不同方式影响 T 细胞的正常功能。首先, anti-CD8 抗体可以改变 T 细胞迁移通过触发细胞内信号级联能够影响细胞骨架的淋巴细胞。其次, anti-CD8 抗体可以调节 CD8 和 MHC I 类分子之间的相互作用, 这是抗原识别过程中的一个重要步骤。第三, 完整的抗体可以绑定到 Fc 受体表达的许多髓细胞分布在肿瘤, 因此容易增加非特异性信号。我们没有迹象表明这一问题影响了我们的数据, 可能是因为居民髓细胞的 Fc 受体与文化中的细胞不同, 在肿瘤环境中饱和了免疫球蛋白。事实上, 在标记过程中添加血清, 一个已知的阻断游离 Fc 受体的过程, 没有改变免疫染色。尽管如此, 没有 fc 区的抗体片段, 以及在其 fc 区域和骆驼抗体片段中突变的抗体,8代表了其他可替代的策略来跟踪带有荧光示踪的驻留细胞。
在过去的几十年中, 几个模型系统已经开发和使用的 real-time 成像的 T 淋巴细胞。这些包括体外的 T 细胞的准备, 以前纯化和培养抗原呈递细胞。这些准备工作在确定抗原识别和反应机制方面取得了显著进展。然而, 它们缺乏组织环境的复杂性。其他的准备工作已经建立, 更紧密地模仿当地组织的结构。例如, 三维胶原凝胶基质, 其中纯化 t 细胞已被植入, 以及 reaggregated 组织片段的培养, 已被用来监测的动态行为的 t 淋巴细胞的荧光成像技术9.这些系统目前的优势, 建筑接近本土组织, 但他们缺乏其他重要的细胞和可溶性因素。在小鼠, 双光子活体显微镜已被用来跟踪 T 细胞在真正的生理环境的一个完整的器官10。然而, 这种方法在技术上很难建立。此外, 小鼠模型显示出显著的差异与人类的生理。
本议定书所描述的技术是一个复杂的多肿瘤环境, 是独特的定位, 作为一个重要的联系之间的共培养研究和动物模型。
本文所描述的协议也可用于跟踪其他细胞的运动, 而不是 CD8 T 淋巴细胞的抗体生成。此外, 该技术可以适应其他人和小鼠的肿瘤和组织。例如, 我们已经能够实时图像的动态 B 细胞标记的 anti-CD19 抗体在新鲜的人扁桃体。
本协议中所描述的技术允许对组织中的 T 细胞运动进行控制的治疗分子进行筛选。文化系统的可及性允许应用一些药理试剂并测试其对 T 细胞迁移的影响。现在人们已经承认, 在生长的肿瘤, CD8 T 细胞表现出低迁移和减少接触与肿瘤细胞11。重要的是, t 细胞在肿瘤细胞区的稀少存在与不良结局相关, 被认为是对癌症免疫治疗的抵抗机制之一。在肿瘤中限制 T 细胞迁移的多重障碍已经被确定, 包括一个稠密的细胞外基质。在这方面, 鉴定能够恢复 T 细胞运动和与恶性细胞相互作用的分子是癌症免疫治疗的一个重要步骤。在先前的研究中, 我们发现胶原酶的部分降解, 对人肺切片有很好的应用, 可以改善 T 细胞与肿瘤细胞的接触。
最后, 将人类肿瘤切片保留在文化中长达数天的可能性7,12,13在 T 细胞和免疫治疗方面提供了许多有希望的应用。然而, 模型系统在长期培养过程中的稳定性是一个重要的参数, 需要进行全面的评估。
获得新鲜和健康的组织是生产优质切片的关键因素, CD8 细胞、肿瘤细胞和基质元素免疫良好。在4° c 前保持肿瘤活检是至关重要的。
用细钳处理切片是该协议中的另一个关键步骤。这应该是非常谨慎的执行, 因为琼脂糖可以很容易损坏。琼脂糖的切割会损害不锈钢垫圈所造成的密封, 从而导致含有溶液的抗体泄漏。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 Bourdoncle 和修士的科钦成像设施 (科钦研究所, 巴黎) 的意见和协助显微镜。这项工作得到了法国甲国家组织癌症、CARPEM (个性化医学癌症研究)、法国基金会和欧洲联盟2020地平线研究和创新方案赠款资助的部分支持。协议 No 667980 (克拉)。
Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |