概要

Записи цельного клеточного зажима с изолированными первичными эпителиальными клетками от эпидидимиса

Published: August 03, 2017
doi:

概要

Мы представляем протокол, который объединяет изоляцию клеток и запись цельноклеточного патч-зажима для измерения электрических свойств первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы. Этот протокол позволяет исследовать функциональные свойства первичных эпидидиальных эпидиальных клеток для дальнейшего выяснения физиологической роли эпидидимиса.

Abstract

Эпидидимис является важным органом для созревания спермы и репродуктивного здоровья. Эпидидиальный эпителий состоит из сложно связанных типов клеток, которые отличаются не только молекулярными и морфологическими особенностями, но и физиологическими свойствами. Эти различия отражают их разнообразные функции, которые вместе создают необходимую микросреду для развития постпикулярных сперматозоидов в эпидидимальном просвете. Понимание биофизических свойств эпидидиальных эпителиальных клеток имеет решающее значение для выявления их функций в области спермы и репродуктивного здоровья как в физиологических, так и в патофизиологических условиях. Хотя их функциональные свойства еще не полностью выяснены, эпидидиальные эпителиальные клетки могут быть изучены с использованием метода патч-зажима, инструмента для измерения клеточных событий и мембранных свойств отдельных клеток. Здесь мы описываем методы изоляции ячеек и записи патч-зажима цельной ячейки в meaЧто электрические свойства первичных диссоциированных эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы.

Introduction

Эпидидимом в мужском репродуктивном тракте является орган, облицованный слоем эпителиальных клеток мозаики. Как и в других эпителиальных тканях, различные клеточные типы эпидидиального эпителия, включая основные клетки, прозрачные клетки, базальные клетки и клетки иммунологических и лимфатических систем, работают согласованным образом, чтобы действовать как барьер на фронте трубочки и как Поддерживающие клетки для созревания спермы и физиологии 1 , 2 , 3 . Таким образом, эти эпителиальные клетки играют важную роль в репродуктивном здоровье.

Эпителиальные клетки, как правило, рассматриваются как невосприимчивые клетки, которые неспособны генерировать все или ничтожные потенциалы действия в ответ на деполяризующие стимулы из-за отсутствия каналов Na + или Ca 2+ с напряжением 4 , 5 . Однако эпителиальные клетки экспрессируют uniНаборов ионных каналов и транспортеров, которые регулируют их специализированные физиологические роли, такие как секреция и транспортировка питательных веществ 6 . Поэтому различные эпителиальные клетки обладают характерными электрическими свойствами. Например, основные клетки экспрессируют CFTR для переноса жидкости и хлора и экспрессируют TRPV6 для реабсорбции кальция, тогда как прозрачные клетки экспрессируют V-АТФазу протонового насоса для люминальной подкисления 1 , 7 , 8 , 9 . Сообщалось о некоторых перевозчиках и ионных каналах, которые регулируют физиологические особенности эпидиальных эпителиальных клеток, но функциональные свойства эпидиальных эпидиальных клеток в значительной степени еще не поняты 10 , 11 , 12 , 13 .

белыйOle-cell patch-clamp – это хорошо зарекомендовавший себя метод для изучения внутренних свойств как возбудимых, так и невосприимчивых клеток, и особенно полезен для изучения функций прежде всего диссоциированных клеток в образцах гетерогенных клеток; Напряжение-зажим используется для измерения пассивных свойств мембраны и ионных токов отдельных ячеек 14 , 15 . Пассивные свойства мембраны включают входное сопротивление и емкость. Первый параметр указывает на внутреннюю проводимость мембраны, в то время как последняя подразумевает площадь поверхности клеточной мембраны (фосфолипидный бислой, где расположены ионные каналы и транспортеры, который служит в качестве тонкого изолятора, разделяющего внеклеточные и внутриклеточные среды). Мембранная емкость прямо пропорциональна площади поверхности клеточной мембраны. Вместе с сопротивлением мембраны, отражаемым входным сопротивлением, постоянная времени мембраны, wПоказывает, насколько быстро потенциал клеточной мембраны реагирует на поток токов ионного канала, можно определить. В связи с этим, комбинируя текущие характеристики отклика от серии этапов напряжения, применяемых к клеткам, определяются биофизическая кинетика и свойства клеток 15 , 16 , 17 , 18 .

В настоящей статье мы описываем процедуры выделения эпителиальных клеток из эпидидимиса кауды крысы и шаги для измерения мембранных свойств различных типов клеток в диссоциированной клеточной смеси с использованием цельноклеточного пластыря. Мы показываем, что основные эпидидимальные клетки проявляют отличные мембранные электрофизиологические свойства и что проводимости можно легко идентифицировать из других типов клеток.

Protocol

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных Университета Шанхая, которые отвечают местным и международным требованиям. 1. Экспериментальные животные Используйт?…

Representative Results

Описанная процедура ферментативного расщепления для выделения эпителиальных клеток из эпидидимидов кауды крысы представляет собой модифицированный протокол из наших предыдущих исследований 9 , 12 . Этот метод дает смесь одиночных кле?…

Discussion

В этом протоколе ферментативная дисперсия эпидидимидов кауды крысы последовательно давала здоровые эпителиальные клетки. Качество эпидидиальных эпителиальных клеток для экспериментов с патч-зажимами зависит от нескольких критических шагов в протоколе. Например, центрифугирование…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора Кристофера Антоса за полезные комментарии к тексту. Эта работа была поддержана начальным финансированием Университета Шанхая, присужденным Винни Шум, и финансированием Национального фонда естественных наук Китая (NNSFC № 31471370).

Materials

Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices – Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices – Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience – HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

参考文献

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. . Special Issue on Ionic Channels II. , 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. . Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H., Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. . Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. , (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).

Play Video

記事を引用
Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

View Video