부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록
概要
우리는 쥐 cauda epididymides에서 일차 해부 상피 세포의 전기적 특성을 측정하기 위해 세포 격리와 whole-cell patch-clamp recording을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 epididymis의 생리적 인 역할을 더 해명하기 위해 원발성 부고환 상피 세포의 기능적 특성을 조사 할 수있게합니다.
Abstract
부고환은 정자 성숙과 생식 건강에 필수적인 기관입니다. 부고환 상피 세포는 분자와 형태 학적 특징뿐 아니라 생리 학적 특성에서도 뚜렷한 복잡하게 연결된 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 차이점은 부고환 내강에서 사후 정자의 발달에 필요한 미세 환경을 함께 구성하는 다양한 기능을 반영한다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특성에 대한 이해는 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서 정자 및 생식 건강에서의 기능을 밝히는데 중요하다. 그들의 기능적 특성은 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 부고환 상피 세포는 단일 세포의 세포 성질 및 막 특성을 측정하기위한 도구 인 패치 클램프 기술을 사용하여 연구 할 수있다. 여기서 우리는 세포 분리 및 전체 세포 패치 클램프 기록 방법에 대해 설명합니다쥐 cauda epididymides에서 일차 분리 된 상피 세포의 전기적 특성을 확인하십시오.
Introduction
남성 생식 기관의 부고환은 모자이크 상피 세포 층이 늘어서있는 기관입니다. 다른 상피 조직에서와 마찬가지로, 주요 세포, 클린 세포, 기저 세포 및 면역계 및 림프계로부터의 세포를 포함하는 부고환 상피의 다양한 세포 유형은 세관 최전선에서 장벽으로서 기능하도록 협조 된 방식으로 작용하며, 정자 성숙 및 생리학을위한 세포 지원 1 , 2 , 3 . 따라서 이러한 상피 세포는 재생산 건강에 필수적인 역할을합니다.
상피 세포는 일반적으로 전위가없는 Na + 또는 Ca 2+ 채널이 없기 때문에 탈분극 자극에 반응하여 모든 또는 전혀 작용하지 않는 전위를 생성 할 수없는 비 흥분성 세포로 간주됩니다 4 , 5 . 그러나, 상피 세포는 유니분비 및 영양소 운반과 같은 전문화 된 생리적 인 역할을 조절하는 이온 채널 및 운반자 세트 6 . 따라서 상이한 상피 세포는 특징적인 전기적 특성을 갖는다. 예를 들어, 주요 세포는 유체 및 염화물 수송을위한 CFTR을 표현하고 칼슘 재 흡수를위한 TRPV6를 발현하지만, 맑은 세포는 내강 산성화 1 , 7 , 8 , 9에 대해 양성자 펌프 V-ATPase를 발현합니다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특징을 조절하는 일부 전달자와 이온 채널이보고되었지만 부고환 상피 세포의 기능적 성질은 아직 많이 밝혀지지 않았다 10 , 11 , 12 , 13 .
ㅁㅁ올 셀 패치 – 클램프 기록은 흥분성 및 비 흥분성 세포의 본질 특성을 조사하기위한 잘 확립 된 기술이며 특히 이종 세포 샘플에서 주로 해리 된 세포의 기능을 연구하는데 유용합니다. 전압 클램프는 단일 막 14 및 15 의 수동 막 특성 및 이온 전류를 측정하는 데 사용됩니다. 수동 막 특성에는 입력 저항 및 커패시턴스가 포함됩니다. 전자의 매개 변수는 고유 멤브레인 컨덕턴스를 나타내지 만, 후자는 세포막의 표면적 (이온 채널 및 운반자가있는 인지질 이중층, 세포 외 및 세포 내 매체를 분리하는 얇은 절연체로 사용됨)을 의미합니다. 막 커패시턴스는 세포막의 표면적에 직접적으로 비례합니다. 입력 저항에 의해 반사되는 멤브레인 저항과 함께 멤브레인 시정 수 which는 세포막 전위가 이온 채널 전류의 흐름에 얼마나 빨리 반응 하는지를 나타낼 수 있습니다. 이와 관련하여, 세포에 적용된 일련의 전압 단계로부터의 전류 응답 특성을 조합함으로써, 생물 물리학 적 동력학 및 세포의 특성이 15 , 16 , 17 , 18로 결정된다 .
본 논문에서는 rat cauda epididymis로부터 상피 세포를 분리하는 절차와 whole cell patch-clamp를 사용하여 해리 된 세포 혼합물에서 각기 다른 세포 유형의 막 특성을 측정하는 단계를 설명한다. 우리는 부고환의 주요 세포가 명확한 막 전기 생리학 적 성질을 나타내며 컨덕턴스가 다른 세포 유형으로부터 쉽게 확인 될 수 있음을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 쥐 cauda epididymides의 효소 분산 일관되게 건강한 상피 세포를 생산. 패치 – 클램프 실험을위한 부고환 상피 세포의 품질은 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 달려있다. 예를 들어, 낮은 원심력 (30 xg)에서 세포 혼합물의 원심 분리는 정자 및 부고환 내강을 제거하는 데 중요합니다. 부고환 상피 세포는 세포 배양에서 정자가 있으면 건강하지 못하게된다. 또한, 해리 된 세포 혼합물…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본문에 대한 도움이되는 의견을 보내 주신 크리스토퍼 안토 스 박사님 께 감사드립니다. 이 작품은 위니 award에게 수여 된 상하이 테크 대학교 (ShanghaiTech University)로부터의 창업 자금과 중국 국립 자연 과학 재단 (NNSFC no. 31471370)의 자금 지원을 받았다.
Materials
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices – Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices – Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience – HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
参考文献
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