概要

Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l'épididyme

Published: August 03, 2017
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概要

Nous présentons un protocole qui combine l'isolation cellulaire et l'enregistrement de patch-clamp à cellules entières pour mesurer les propriétés électriques des cellules épithéliales dissociées primaires des épididymides de cauda de rat. Ce protocole permet d'étudier les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales épididymiques primaires afin d'élucider davantage le rôle physiologique de l'épididyme.

Abstract

L'épididyme est un organe essentiel pour la maturation du sperme et la santé reproductive. L'épithélium épididymal se compose de types cellulaires complexes qui sont distincts non seulement dans les caractéristiques moléculaires et morphologiques, mais aussi dans les propriétés physiologiques. Ces différences reflètent leurs diverses fonctions qui, ensemble, établissent le microenvironnement nécessaire pour le développement du sperme post-testiculaire dans la lumière épididymique. La compréhension des propriétés biophysiques des cellules épithéliales épididymatiques est essentielle pour révéler leurs fonctions dans le sperme et la santé reproductive, dans des conditions physiologiques et pathophysiologiques. Bien que leurs propriétés fonctionnelles n'aient pas encore été pleinement élucidées, les cellules épithéliales épididymatiques peuvent être étudiées à l'aide de la technique de patch-clamp, un outil pour mesurer les événements cellulaires et les propriétés membranaires des cellules individuelles. Ici, nous décrivons les méthodes d'isolement cellulaire et d'enregistrement de patch-clamp à cellules entières pour meaAssurez-vous que les propriétés électriques des cellules épithéliales dissociées primaires des épididymides de la queue de rat.

Introduction

L'épididyme dans le tractus reproducteur masculin est un organe doublé d'une couche de cellules épithéliales en mosaïque. Comme dans d'autres tissus épithéliaux, les différents types cellulaires de l'épithélium épididymal, y compris les cellules principales, les cellules claires, les cellules basales et les cellules des systèmes immunologiques et lymphatiques, fonctionnent de manière concertée pour fonctionner comme barrière à la ligne de front du tubule et en tant que Cellules de soutien pour la maturation du sperme et la physiologie 1 , 2 , 3 . Ainsi, ces cellules épithéliales jouent un rôle essentiel dans la santé reproductive.

Les cellules épithéliales sont généralement considérées comme des cellules non excitables qui ne permettent pas de générer des potentiels d'action tout ou rien en réponse à des stimuli dépolarisants, en raison du manque de canaux Na + ou Ca 2+ 4 , 5 de tension. Cependant, les cellules épithéliales expriment uniQuels ensembles de canaux ioniques et de transporteurs qui régulent leurs rôles physiologiques spécialisés, tels que la sécrétion et le transport d'éléments nutritifs 6 . Par conséquent, différentes cellules épithéliales possèdent des propriétés électriques caractéristiques. Par exemple, les cellules principales expriment le CFTR pour le transport des fluides et des chlorures et expriment le TRPV6 pour la réabsorption du calcium, tandis que les cellules claires expriment la pompe à protons V-ATPase pour l'acidification luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Certains transporteurs et canaux ioniques qui régulent les caractéristiques physiologiques des cellules épithéliales épididymatiques ont été rapportés, mais les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales épididymatiques ne sont pas encore comprises 10 , 11 , 12 , 13 .

WhL'enregistrement de la pince à l'aide d'une cellule oléicole est une technique bien établie pour examiner les propriétés intrinsèques des cellules excitables et non excitables et est particulièrement utile pour étudier les fonctions des cellules principalement dissociées dans des échantillons cellulaires hétérogènes; La tension de serrage est utilisée pour mesurer les propriétés de la membrane passive et les courants ioniques des cellules individuelles 14 , 15 . Les propriétés de la membrane passive comprennent la résistance d'entrée et la capacité. Le premier paramètre indique la conductance de la membrane intrinsèque, tandis que ce dernier implique la surface de la membrane cellulaire (une bicouche de phospholipides, où se trouvent les canaux ioniques et les transporteurs, qui sert d'isolant mince séparant les milieux extracellulaires et intracellulaires). La capacité de la membrane est directement proportionnelle à la surface de la membrane cellulaire. Avec la résistance de la membrane qui est réfléchie par la résistance d'entrée, la constante de temps de la membrane, wCe qui indique la rapidité avec laquelle le potentiel de la membrane cellulaire répond au flux des courants des canaux ioniques, peut être déterminé. À cet égard, en combinant les caractéristiques de réponse actuelles d'une série d'étapes de tension appliquées aux cellules, la cinétique biophysique et les propriétés des cellules sont déterminées 15 , 16 , 17 , 18 .

Dans le présent document, nous décrivons les procédures d'isolement des cellules épithéliales à partir de l'épididyme de la queue du rat et les étapes pour mesurer les propriétés de la membrane de différents types de cellules dans le mélange de cellules dissociées en utilisant la pince à cellules entières. Nous montrons que les cellules principales épididymiques présentent des propriétés électrophysiologiques membranaires distinctes et que les conductances peuvent être facilement identifiées à partir d'autres types de cellules.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées conformément aux directives du Comité d'aide et de soins aux animaux institutionnels de ShanghaiTech University, qui répondent aux exigences locales et internationales. 1. Animaux expérimentaux Utiliser des rats Sprague-Dawley mâles adultes (~ 300-450 g) entre 8-12 semaines. À cet âge chez les rats, les spermatozoïdes sont arrivés dans les épididymides de la cauda. 2. Isolation …

Representative Results

La procédure de digestion enzymatique décrite pour l'isolement des cellules épithéliales à partir des épididymides de la queue de rat est un protocole modifié de nos études précédentes 9 , 12 . Cette méthode produit un mélange de cellules simples avec une viabilité de plus de 90% et sans ampoule de surface ou volume de cellules gonflées. Le mélange cellulaire hétérogène se compose principalement de cellules …

Discussion

Dans ce protocole, la dispersion enzymatique des épididymides de cauda de rat a consisté à produire des cellules épithéliales saines. La qualité des cellules épithéliales épididymatiques pour les expériences de patch-clamp dépend de quelques étapes critiques du protocole. Par exemple, la centrifugation du mélange cellulaire à une faible force centrifuge (30 xg) est importante pour éliminer les spermatozoïdes et la teneur en luminescence épididymique; Les cellules épithéliales épididymiques deviennent…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Christopher Antos pour des commentaires utiles sur le texte. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de ShanghaiTech University attribués à Winnie Shum et par le financement de la National Natural Science Foundation of China (NNSFC n ° 31471370).

Materials

Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices – Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices – Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience – HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

参考文献

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
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記事を引用
Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

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