Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.
Recente ontwikkelingen in de genetica en systemen biologie technologieën hebben ons begrip van de biologie van malariaparasieten op moleculair niveau bevorderd. Effectieve malariaparasiet doelen voor de ontwikkeling van vaccins en chemotherapie zijn echter nog steeds beperkt. Dit is grotendeels te wijten aan de onbeschikbaarheid van relevante en praktische in vivo infectie modellen voor menselijke Plasmodium soorten, met name voor p. falciparum jp p. vivax. Daarom zijn knaagdier malaria soorten uitgebreid gebruikt als praktisch alternatief in vivo modellen voor malaria vaccin, drug targeting, immuunrespons, en functionele karakterisering studies van gecondengeerde Plasmodiumspp. genen. Inderdaad, knaagdier malaria modellen zijn van onschatbare waarde gebleken, vooral voor het verkennen van mug transmissie en lever stage biologie, en waren onmisbaar voor immunologische studies. Echter, er zijn verschillen in de methoden die worden gebruikt voor het evalueren van de fenotypes van transgene en wild-type ongeslachtelijke en seksuele bloed-fase parasieten. Voorbeelden van deze verschillen zijn de keuze van een intraveneuze versus intraperitoneale infectie van knaagdieren met bloed-fase parasieten en de evaluatie van mannelijke gameten exflagellatie. Hierin worden gestandaardiseerde experimentele methoden beschreven voor het evalueren van de fenotypes van ongeslachtelijke en seksuele bloed stadia in transgene parasieten die verslag doen van Reporter-gen of wild type knaagdier malariaparasieten. We ook detail de methoden voor het evalueren van de fenotypes van malariaparasiet muggen stadia (gameten, ookinetes, oöcysten, en sporozoites) in Anopheles muggen vectoren. Deze methoden zijn gedetailleerd en vereenvoudigd hier voor de dodelijke en niet-dodelijke stammen van p. berghei jp p. yoelii maar kan ook worden toegepast met enkele aanpassingen aan p. chabaudi jp p. vinckei knaagdier malaria soorten.
Malariaparasieten veroorzaken honderden miljoenen malaria-infecties bij mensenwereld wijd, met meer dan 600.000 sterfgevallen per jaar1. Menselijke infecties worden veroorzaakt door vijf malaria parasitaire soorten, namelijk p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, en p.kennis. De meeste klinische malaria sterfte wordt veroorzaakt door P. falciparum in Afrika ten zuiden van de Sahara1. Een andere menselijke malariaparasiet soorten die grote wereldwijde Morbiditeiten buiten het Afrika bezuiden de Sahara veroorzaakt is P. vivax2. De andere drie soorten zijn allemaal meer geografisch beperkt en veroorzaken goedaardige malaria-infecties, behalve de dodelijke P. Prosi3. De onbeschikbaarheid van relevante en praktische niet-humane in vivo-modellen van infecties is altijd geweest en is nog steeds een belemmering voor malaria vaccin en Geneesmiddelenontwikkeling. Eerdere malaria drugs targeting en metabole studies hebben uitgebreid vertrouwd op aviaire malaria modellen zoals p. gallinaceum jp p. lophurae, het infecteren van kippen en eenden, respectievelijk4. Daarna werden knaagdier malaria soorten geleidelijk geïntroduceerd in verschillende vaccins en drugs targeting studies als in vivo modellen. In de loop der jaren, het bewijs van gelijkenissen van de biologie en gastheer-parasiet interacties van de levenscyclus stadia van knaagdieren malaria modellen aan menselijke malaria soorten hebben opgebouwd.
In het bijzonder waren Knaagdieren malaria modellen uiterst belangrijk om de biologie van muggen en pre-erytrocytische stadia5te verkennen en karakteriseren. Er zijn echter vier Knaagdieren malaria soorten (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, en p. vinckei) die verschillende biologische kenmerken hebben, waarvan de meest opvallende in de bloed stadia6. Knaagdier malaria soorten verschillen in de synchroniciteit van bloed stadia, waarbij bloed stadia van p. chabaudi jp p. vinckei stammen zijn meestal synchroon, terwijl het bloed stadia van p. berghei jp p. yoelii zijn niet6 , 7. een ander opmerkelijk verschil is de zelf klaring van bloed stadia die voorkomt in sommige stammen (bijv. p. yoelii 17x-nl, p. berghei NK65 en P. vinckei lentum), terwijl de bloedinfectie van andere stammen van dezelfde soort kunnen dodelijk zijn indien onbehandeld (P. yoelii 17x-L, p. berghei ANKA, en P. chabaudi as). Bovendien, p. yoelii 17x-nl stam en p. berghei ANKA stam bij voorkeur de reticulocyten8,9,10,11, hoewel deze kenmerken van p. yoelii jp P. berghei stammen zijn niet een strikte groei eis12,13,14. Daarom worden muizen behandeld met fenylhydrazine voorafgaand aan een infectie met de bloed stadia van die parasieten om de parasitemie en gametocytemia te verhogen die nodig zijn voor een mug-infectie voor de p. berghei ANKA-stam en voor p. yoelii 17x-nl15,16,17,18,19.
Verschillen in muggen stadia ontwikkeling bestaan ook tussen verschillende Knaagdieren malaria soorten, de meest opvallende is de temperatuur en de tijd die nodig zijn voor optimale muggen stadia ontwikkeling en de sporozoite lengte5,6, 20. In pre-erytrocytische stadia van knaagdier malaria soorten, verschillen omvatten de knaagdieren soorten en stam die het meest vatbaar zijn voor infectieuze sporozoïet inoculatie, het aantal sporozoieten nodig voor de inoculatie in een gevoelige knaagdier stam, de zoogdier celtypen nodig voor in vitro lever fase ontwikkeling testen, en de tijd om te voltooien van de ontwikkeling van de lever fase5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Ondanks deze variabele waren knaagdieren malariaparasieten eerder de gunstige modellen voor de toepassing van omgekeerde genetische benaderingen, omdat ze minder tijd en middelen verbruiken met een grote kans op succes31. In feite, knaagdieren malaria modellen waren de beste modellen, en in veel gevallen de enige modellen, beschikbaar voor vele jaren om functioneel te karakteriseren genen uitgedrukt in muggen en lever stadia.
In het licht van de populariteit en de mogelijkheden van omgekeerde genetische benaderingen in knaagdieren malaria modellen, een aantal verschillende methodologieën zijn gebruikt voor het analyseren van de fenotypes van transgene parasiet levenscyclus stadia, met name bloed stadia. Sommige van deze methoden zijn echter inconsistent; bijvoorbeeld, het vergelijken van infecties van bloed-fase parasieten na een IP-injectie (die mogelijk worden afgevoerd naar de peritoneale lymfeklieren en, vanaf daar, kan de bloedbaan in te voeren; daarom, de geïnjecteerde parasieten eindigen niet in de bloedbaan gelijk) , het vergelijken van de Mosquito transmissie van klonen met een verschillend aantal seriële bloed-fase overdrachten of G-nummer (die invloed kunnen hebben op gametocytogenesis32,33), of het vergelijken van transgene parasieten rechtstreeks naar naïef wild-type (WT) parasieten die nooit werden onderworpen aan elektroporation en positieve drug selectie en de verschillende niet-gestandaardiseerde evaluaties van mannelijke gameten exflagellatie. Daarom is het cruciaal om protocollen te standaardiseren die eenvoudig te volgen zijn voor de fenotypische analyse van elk type transgene of WT knaagdier malariaparasieten in het bloed en in de mug om tegemoet te komen aan de biologische variabele van knaagdieren malaria parasietsoorten.
Hierin rapporteren we over een gestandaardiseerd, gedetailleerd experimenteel protocol voor de fenotypische analyse van het bloed en de levenscyclus van muggen van transgene of wild-type p. yoelii jp p. berghei parasieten. Deze protocollen zijn ook van toepassing op p. chabaudi jp p. vinckei parasieten.
Ondanks de gelijkenis in de algemene biologie van hun levenscycli tot die van menselijke malariaparasieten, hebben muizen malaria modellen ook veel gelijkenissen met menselijke Plasmodium soorten die hun gebruik als betrouwbaar in vivo modellen zouden beperken. Bijvoorbeeld, met uitzondering van levende verzwakte parasieten als vaccins, alle vaccin studies met subeenheid en DNA en andere vaccins gaven uitstekende resultaten in het muismodel, maar bij mensen die in endemische gebieden wonen, waren de res…
The authors have nothing to disclose.
Ahmed Aly wordt gesteund door financiering aan de Bezmialem Vakif Universiteit van het Turkse Ministerie van ontwikkelings subsidie 2015BSV036, en door financiering door de Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine, en door financiering van NIH-NIAID voor R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
26G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
1 ml TB Syringe, 26G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
1 cc Insulin Syringe, U-100 27G | Becton Dickinson | 329412 | |
Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
RPMI | Gibco | 22400105 | |
DMEM | Gibco | 11995065 | |
Pencillin/ Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |