세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

연구는 원즈 워드 지역 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다 (참조 번호 : 06 / Q0803 / 37) 및 연구 개발 사무실에서받은 기관의 승인. 모든 환자는 동의서를 작성했다. 세포 외 기질 단백질의 1 추출 참고 :이 실험에 사용 된 인간의 심방 조직은 단지 마음의 심정지 체포 후, 체외 순환시 심방 부속기에서 얻었다. 모든 샘플은 세인트 조지 병원, 런던, 영국에서 수집되었다. 모든 조직 샘플은 -80 ° C에서 냉동해야합니다. 이러한 파라 포름 알데히드 등의 휘발과 보존 샘플을 사용 가교 단백질이하지 마십시오. 추출 단계 사이의 시간을 최소화하기 위해, 표 1에 따라, 실험에 앞서 모든 추출 버퍼를 준비한다. 온도가 조절 된 환경에서, 실온 (RT)에서 배양 모두를 수행(즉, ~ 20 ° C는) 추출 간의 일관성을 보장합니다. 조직 20-50 mg의 무게. 여러 샘플을 추출 잘라 하나씩 무게 될 경우 조직의 전체 해동을 방지 할 수 있습니다. 메스를 사용하여 3-4 작은 조각 (예 2-3 ㎜)로 조직을 주사위 1.5 ㎖의 튜브에 이들을 함께 배치했다. (PBS; 표 1 및 재료의 도표 참조)를 빙냉 인산염 완충 식염수 500 μL를 첨가하고 혈액 오염을 최소화하기 위해 다섯 개 세척을 수행한다. 추출 단계 1 : 염화나트륨 완충액 포란 PBS로 세정 한 후, 스크류 캡과 1.5 ㎖의 튜브에 시료를 배치했다. 염화나트륨 버퍼를 추가 티슈 중량 : 10 배 (w V)로 (표 1 참조). 소용돌이 최저 속도 (즉, 600 RPM)에서 1 시간 동안 RT에서 튜브. 참고 : 낮은 소용돌이 속도가이 단계에서 조직의 기계적 중단을 방지하는 것이 중요합니다.추출 동안 모든 튜브를 배치 할 폼 어댑터를 사용하십시오. 39 ° C에서 10 분 동안 16,000 XG에 새로운 원심 분리 튜브로 이동 추출물. 사용할 때까지 -20 ° C에서 추출물을 저장합니다. 간단히 말해서, 신선한 염화나트륨 완충액 나머지 조직 펠렛을 세척 하였다. 버퍼의 동일한 유형을 사용하여 (즉, 염화나트륨 완충액 100 μL) 세척 다른 용해도 (염화나트륨으로 추출하지 예, 단백질)과 다른 단백질의 추출을 방지 할 수있다. 세정 후, 후속 추출 단계와 단백질 함량의 중첩을 최소화하기 위해 버퍼의 완전한 제거를 보장한다. 세척에 사용 된 염화나트륨 완충액 버린다. 주 : 상기 버퍼 볼륨 조직 중량의 비율은 재현 추출 중요하다. 10 : 1의 비율 (V는 : W) 및 염화나트륨 SDS 추출 및 5 : 1 GuHCl 단계에 대한 버퍼 포화없이 단백질의 충분한 양을 제공한다. 단백질 농도는 약 내선 후 1 ~ 2 ㎍ / μL이다raction. 추출 단계 2 : SDS 버퍼와 탈세 포화 열 번 (V : w)에서 SDS 완충액 (표 1)를 추가 티슈 중량; SDS 낮은 농도 (즉, 0.1 %)를 사용 탈세 포화시 ECM 단백질의 손실을 방지하는 것이 중요하다. 소용돌이 최저 속도 (즉, 600 RPM)에서 16 시간 동안 실온에서 튜브. 참고 : 낮은 소용돌이 속도가 ECM의 기계적 중단을 최소화 할 수 있습니다. 새로운 튜브에 추출물을 전송합니다. 39 ° C에서 10 분 동안 16,000 XG 원심 분리기; 사용할 때까지 -20 ° C에 저장합니다. 간단히 SDS를 제거 DD의 H 2 O로 나머지 조직 펠렛을 세척 하였다. 세척 후 액체의 완전한 제거를 확인합니다. 추출 단계 3 : GuHCl 버퍼와 배양 (: w V) 티슈 중량 다섯 시간 GuHCl 완충액 (표 1)을 추가한다. 소용돌이 즉 최대 속도로 72 시간 (실온에서 튜브 </EM> 3,200 RPM); 격렬한 소용돌이로 교반은 ECM의 기계적 중단을 용이하게합니다. 새로운 튜브에 추출물을 전송합니다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 10 ℃에서 4 분, 점포 16,000 × g에서 원심 분리기. 2. 단백질 정량 및 강수량 참고 세제의 존재로 인해 상기 SDS 완충액은 280 nm에서 흡광도 측정에 기초하여 직접 단백질 정량과 호환된다. 재현 정량을 보장하기 위해 모든 단백질 추출물 (17)에 대한 비색 분석을 사용합니다. 부량. 직렬 적절한 추출 완충액 (예, 염화나트륨, SDS, 또는 GuHCl) (17)에 희석 된 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 검량선 표준을 준비한다. 이 기간 동안, 샘플 추출을 해동. 내 농도를 수득하는 추출 완충액에 희석 시료흡광도의 선형 범위; 1:10 희석 (V는, V) 만족스러운 결과를 산출한다. 비색 분석법> 4 M GuHCl 농도와 호환되지 같이 DDH 2 정량 O 동일한 양으로 GuHCl 샘플을 희석한다. bicinchoninic 산 (BCA)를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 분석을위한 제조사의 지침에 따라 색채 분석 (17) (재료의 도표 참조) 계; 적어도 중복 측정을 수행하는 것이 좋습니다. 30 분 동안 배양 한 후, BSA 표준 검량선 (17)를 사용하여 단백질 농도를 계산하기 위해 570 nm 파장에서의 흡광도 측정을 수행. 단백질 침전 해동 GuHCl 실온에서 추출합니다. 나누어지는 새로운 튜브에 각 샘플의 단백질 10 μg의. 직접 글리코 펩티드 분석을 위해 분취를 50㎍. 에탄올과 인큐의 10 배 볼륨 추가BATE 밤새 -20 ℃에서. 참고 : GuHCl 더 효소 반응과 대부분의 전기 응용 프로그램과 호환되지 않습니다. GuHCl의 제거는 탈 글리코 실화 트립신 소화하기 전에 필요합니다. 에탄올과 GuHCl의 용해도는 반대로, 단백질의 낮은 용해도는 약 18 단백질의 98 % 회수를 산출하면서 GuHCl의 효과적인 제거를 허용한다. 39 ° C에서 30 분 동안 16,000 × g에서 원심 분리하고 상등액을 흡인. 침전 된 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. RT에서 진공 농축기 (물질의 표를 참조)를 사용하여 15 분 동안 펠렛을 건조. 참고 :이 프로토콜은 여기 중지 할 수 있으며, 건조 된 펠렛 사용할 때까지 -20 ° C에 저장됩니다. 선택적으로, (보조 방법을 참조 QC) 품질 관리 등의 겔 전기 영동으로 실행. 3. 연속 탈 글리코 실화N-당화 부위 점유율의 평가 샘플 건조하여 (단계 2.2.2 참조) 동안, 표 1에서와 같이, 탈 글리코 실화 효소를 함유하는 탈 글리코 실화 debranching 버퍼를 준비한다. 제품의 자세한 내용은 자료의 표를 참조하십시오. 각 샘플에 대한 탈 글리코 실화 효소를 함유하는 완충액 10 μL를 추가한다. 빠른 소용돌이 및 샘플의 스핀 다운을 수행하여 적절한 펠렛 재 부유를 확인합니다. 참고 : debranching 효소를 사용하여 설탕 단량체의 제거는 O 연결된 복합 당류의 후속 완전한 제거를 위해 필수적이며, MALDI 스펙트럼은 PNGase-F에 의한 N- 연결 당의 나중에 분해를 촉진한다. 37 ° C의 온도에 의한 헤파 II.Increase 헤파 란 황산의 제거를 허용하고 교반과 함께 36 시간 동안 배양 25 ° C에서 2 시간 동안 인큐베이션. 참고 : 낮은 반응 볼륨과 장기 배양 시간, 사용 인큐베이터 뜨는을 감안할 때 단단히 복수의 1.5 ML의 욕조 팩약 45 ° 기울고 인큐베이터 안에 50ml의 원뿔형 튜브 내부 ES. 36 시간 후, 16,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리 그리고 증발 약 45 분 동안 실온에서 진공 농축기를 사용하여 샘플에서 H 2 O. 50 U / ㎖의 MALDI 스펙트럼은 PNGase-F를 포함하는 H 2 O 18 10 μL로 건조 된 샘플을 절단하는 재현 탁 탈 아미드 화 반응의 모든 아스파라긴 결합 형 글리 칸. 참고 : 생성 아스파라긴산은 MS 분석에서 N 글리코 실화의 존재를 나타내는 2.98 다 과량의 물질을 운반한다. 인큐베이터 통 일정 교반하에 37 ℃에서 36 시간 동안 배양. 4. 트립신 용액 인 소화 주의 :이 단계는 (모두 비 탈글 라이코 실화 된 (즉, 글리코 펩티드 직접 분석에 사용되는) 및 탈글 라이코 실화 된 샘플들에 대해 수행되어야한다, 즉, 당쇄 OC의 평가에 사용cupancy). N-글리코 실화 부위 점유율의 평가 (이전 단계에서 표시)에 대한 총 단백질의 10 μg의를 사용합니다. 글리코 직접 분석 대상 시료를 들어, 개시 량으로 50 μg의 단백질을 사용한다. 참고 : 다음 단계는 단백질 10 μg의 설명된다. 필요에 따라 일 evolumes (즉, 5 시간 50 μg의 위해를)까지 확장 할 수 있습니다. 각각 6 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 최종 농도 9 M 우레아, 3 M 티오 우레아를 사용하여 각 샘플의 분취 량의 단백질을 변성 (10 μL의 시료에 대하여, 예를 들면, 우레아 / 티오 20 μL). 100 밀리미터 dithiotreitol (10 mM의 DTT, 3.33 μL, 최종 농도)을 첨가하여 단백질을 줄인다. 240 rpm으로 교반하면서 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. (50 mM의 최종 농도 3.7 μL) 0.5 M 요오도 아세트 아미드를 첨가하여 알킬화를 수행하기 전에 샘플을 실온으로 식혀. 1 시간 동안 어두운 데에서 인큐베이션. -20 (사전 냉장 사용° C) 아세톤 (샘플의 6 배 부피)을 -20 ℃에서 밤새 배양 샘플. 4 ℃에서 25 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리하여 침전물. 뜨는을 대기음. 침전 된 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. RT에서 30 분 동안 진공 농축기를 이용하여 단백질 펠렛을 건조. 0.1 M 트리 에틸 암모늄 바이 카보네이트 (TEAB) 완충액, pH가 8.2 20 μL에 재현 탁 함유 트립신 (0.01 ㎍ / μL) 및 37 ° C에서 240 rpm으로 밤새 다이제스트. (1 % TFA의 최종 농도 TFA, 2 μL) 10 % 트리 플루오로 아세트산과 샘플을 산성화하여 소화를 중지. C18 열을 사용하여 5. 펩타이드 정리 주 : 분해 후에 펩티드 혼합물로부터 오염물의 제거를 방해 이온 진압을 줄이고 신호 – 대 – 잡음 비율 및 연속 커버리지를 개선한다. 이 단계는 모두 비 탈글 라이코 실화 및 탈글 라이코 실화 사를 위해 수행되어야한다mples. 1 분 동안 1,000 XG에서 원심 웰 당 200 μL의 메탄올을 사용하여 C18 스핀 플레이트 수지 (재료의 도표 참조) 활성화. 1 분 동안 1,000 XG에서 H 2 O. 원심 분리기에서 80 % 아세토 니트릴 (ACN), 0.1 % TFA의 웰 당 200 μL를 첨가하여 세척 하였다. 1 분 동안 1,000 XG에서 H 2 O. 원심 1 % ACN 0.1 % TFA의 웰 당 200 μL를 첨가하여 평형. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 1 분 동안 1,500 XG에 수지 원심 분리기를 포함하는 웰에 4 단계 샘플 (전체 부피)을로드. 흐름 -을 통해 두 번 다시 넣고 원심 분리를 반복합니다. 1 분 동안 1,500 XG에서 H 2 O. 원심 1 % ACN 0.1 % TFA의 웰 당 200 μL를 첨가하여 세척 하였다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 1 분 동안 1,500 XG에서 H 2 O. 원심 분리기에서 50 % ACN 0.1 % TFA의 웰 당 170 μL로 샘플을 용출. 이전 단계를 반복그리고 수집 된 용출액을 결합한다. RT에서 2 시간 동안 진공 농축기를 사용하여 용출을 건조. 그것이 바로 사용하지 않을 경우, 사용할 때까지 -80 ° C에서 건조 된 샘플을 유지한다. 참고 : 단백질 식별을위한 탈글 라이코 실화 샘플은이 단계 이후 LC-MS / MS에 사용할 준비가 된 것입니다. 6 단계와 7은 이러한 샘플 필요하지 않습니다. 해동 0.5 ㎍ / μL의 최종 단백질 농도로 H 2 O 2 % ACN 및 0.05 % TFA의 탈글 라이코 실화 된 샘플을 재현 탁. 비 탈글 라이코 실화 된 샘플들의 직접 글리코 분석 단계 6으로 진행. 선택적으로, 종래의 탠덤 질량 태그 (TMT)로 라벨링 펩티드 필터; 펩티드 fitration위한 보조 방법 참조. TMT 6. 라벨 (직접 글리코 펩타이드 분석을위한 전용) 해동 및 1 개 ㎍ / μL의 농도를 얻기 위해 50 mM의 TEAB 50 μL에 건조 된 펠렛을 재현 탁. ResusPED TMT 제로의 0.8 mg을 바이알 ACN 41 μL에 시약 (TMT 0, 재료의 도표 참조). 부유 제조업체의 recommendantions을 따르십시오. (TMT 0 20.5 μL로 펩티드 즉, 50 μL), 0.4 mg의 TMT 0 ~ 50 개 μg의 펩티드의 비율 펩티드 샘플 라벨. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 비율 6에서 5 %의 히드 록실 아민을 첨가하여 라벨링 반응을 켄 칭하고, 100 (5 % 히드 록실 아민, 즉 4.23 μL). 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. 진공 농축기를 이용하여 실온에서 1 시간에 대해 0 TMT -labelled 펩티드 시료를 건조. DDH 2 O. 10 μL에 재현 탁 참고 : 인해 글리 칸 잔류에, 글리코 펩타이드를 비 당화 펩티드보다 높은 분자량을 표시합니다. TMT 0 글리코 펩티드의 충전 상태를 증가시킨다. 이것은 (m / z)의 비율을 충전하는 상대적인 질량을 줄이고 ETD 조각을 용이하게한다. (7). 글리코 펩타이드 농축 키트 (물질의 표를 참조)에 제공되는 반응 완충제를 사용한다. 단계 6.5에서 각각 10 μL 샘플을 결합 완충액 50 μL를 추가한다. 이 균질해질 때까지 glycocapture 수지 용액을 소용돌이. (15)을 캡처 기반의 양쪽이 온성 친수성 상호 작용 액체 크로마토 그래피 (ZIC-HILIC)을 사용합니다. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 수지 현탁액의 분취 액 50 μL. 2,500 XG에서 1 분 동안 스핀 상층 액을 제거한다. 시료 60 μL를 추가 (즉, 결합 완충액으로 샘플) 수지 펠렛을 함유하는 튜브. 피펫을 사용하여 혼합하고 1200 rpm에서 교반하면서 20 분 동안 RT에서 배양한다. 2,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리하고 새로운 튜브로 상청액을 이전. 튜브를 유지합니다. 수지 튜브에 세척 완충액 150 μL를 추가한다. 피펫을 사용하여 혼합하고 1200 rpm에서 교반하면서 10 분 동안 RT에서 배양한다. 2,500 × g으로 2 분 동안 스핀. 이전(단계 7.4)에서 동일한 튜브에 상청. 세척이 두 번 단계를 반복합니다. 용출 버퍼의 75 μL를 추가하고 피펫을 사용하여 섞는다. RT에서 5 분 동안 1,200 rpm으로 교반 한 후 2,500 × g으로 2 분 동안 튜브를 원심 분리. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 상청을 전송. 세정 단계를 반복하고 동일한 튜브에 용출 상등액 옮긴다. g X 2500에서 2 분 동안 용출 (즉, 글리코 펩티드)을 함유하는 튜브를 원심 분리기. 이전 단계로부터의 임의의 잔류 수지 제거를 위해 새로운 튜브에 상청을 전송. RT에서 약 2 시간 동안 진공 농축기를 이용하여 용출 총 150 μL를 건조. DDH 2 O.에서 2 % ACN 15 μL 0.05 % TFA의 건조 다운 글리코 펩티드를 재현 탁 글리코 특성화 HCD와 ETD 단편화를 이용하여 ECM 단백질 조성물을 분석 HCD 단편화를 이용하여 LC-MS / MS를 수행하도록 진행하고, LC-MS / MS. 섹션 8을 참조하십시오. </oL> 8. 질량 분광법 분석 전자 재료 조성물의 단백질을 분석 HCD 단편화를 이용하여 LC-MS / MS를 수행; 자세한 내용은 보충 방법을 참조하십시오. (자세한 보충 방법 참조) 글리코 특성화 HCD와 ETD 단편화를 이용하여 LC-MS / MS를 수행; 농축 된 샘플을 비 – 농후 입력 재료 (15)와 비교한다. 주 : 간접 분석 글리코 펩타이드, 글리코 펩타이드 직접 분석 및 데이터베이스 검색 용 LC-MS / MS 법의 상세한 설명은 보충하는 방법에 제공된다. 질량 분석기를 사용하여 ECM 단백질과 글리 칸 성분의 특성에 관심이 연구팀은 이전의 출판물 3, 11, 15를 참조하는 것이 좋습니다.