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生化学

Glycoprotéomique de la matrice: Une extracellulaires Méthode d'analyse Intact glycopeptides En utilisant la spectrométrie de masse

Published: April 21, 2017
doi:
10.3791/55674
, , , ,
1King’s British Heart Foundation Centre,King’s College London

概要

Ce document décrit une méthode pour préparer des échantillons de tissus cardio-vasculaires pour l'analyse MS qui permet (1) l'analyse de la composition des protéines ECM, (2) l'identification des sites de glycosylation, et (3) la caractérisation de la composition des formes glycanniques. Cette méthode peut être appliquée, avec des modifications mineures, à l'étude de l'ECM dans d'autres tissus.

Abstract

La fibrose est une caractéristique de nombreuses maladies cardio-vasculaires et est associée à la sécrétion et le dépôt exacerbé de la matrice extracellulaire (ECM). Utilisation de la protéomique, nous avons déjà identifié plus de 150 ECM et des protéines associées ECM dans les tissus cardiovasculaires. En particulier, de nombreuses protéines ECM sont glycosylée. Cette modification post-traductionnelle affecte le repliement des protéines, la solubilité, la liaison et la dégradation. Nous avons développé une extraction séquentielle et un procédé d'enrichissement de protéines de la MEC qui est compatible avec l'analyse par spectrométrie de masse en tandem de chromatographie en phase liquide suivant (LC-MS / MS) des glycopeptides intactes. La stratégie est basée sur incubations séquentielles avec NaCl, SDS pour décellularisation d'un tissu, et le chlorhydrate de guanidine pour la solubilisation des protéines de la MEC. Les progrès récents dans LC-MS / MS comprennent des méthodes de fragmentation, telles que des combinaisons de dissociation de collision énergie plus élevée (HCD) et la dissociation de transfert d'électrons (ETD), qui permettentl'analyse de la composition directe des glycopeptides de protéines ECM. Dans le présent document, on décrit un procédé pour préparer l'ECM à partir d'échantillons de tissus. La méthode permet non seulement pour le profilage de protéines, mais aussi l'évaluation et la caractérisation des glycosylation par analyse MS.

Introduction

Fibrose est une caractéristique de nombreuses maladies. Les fibroblastes prolifèrent et se différencient en direction de phénotypes très synthétiques, qui sont associées à la sécrétion et le dépôt exacerbé de la matrice extracellulaire (ECM) 1. Excessive dépôt ECM peut se poursuivre, même après la blessure initiale a diminué, ce qui conduit à une déficience fonctionnelle. Utilisation de la protéomique, nous avons déjà identifié plus de 150 ECM et des protéines associées ECM dans le tissu cardiaque 2, 3. Ils ne sont pas seulement des protéines structurales, mais aussi des protéines matricellulaires et protéases qui contribuent au remodelage continu et l'adaptation dynamique du cœur. En particulier, de nombreuses protéines ECM sont glycosylés 4. Cette modification post-traductionnelle (PTM) implique l'addition de résidus de sucre à certaines positions d'acides aminés, et elle affecte le repliement des protéines, la solubilité, la liaison et la dégradation 5 </sup>.

Il existe deux principaux types de glycosylation qui se produisent chez les mammifères. (1) N-glycosylation se produit à l'azote carboxamido des résidus asparagine (Asn) au sein de la séquence consensus Asn-Xaa-Thr / Ser, où Xaa est un acide aminé quelconque à l'exception de la proline. (2) O-glycosylation, des résidus de sucre se fixent aux résidus de serine et la threonine (Ser, Thr) ou, dans une moindre mesure, à hydroxyproline et hydroxylysine. Bien que O-glycosylation peut se produire dans une variété de groupes de protéines, N-glycosylation est limitée à des protéines sécrétées ou des domaines extracellulaires de protéines membranaires 5. Cela rend N-glycosylation une cible lors de l'étude de l'ECM.

Proteomics établit une nouvelle norme pour l'analyse des changements de protéine dans la maladie. Jusqu'à présent, la plupart des études protéomiques ont été axées sur les protéines intracellulaires 6. Ceci est principalement dû aux raisons suivantes. Tout d'abord, les protéines intracellulaires abondantes entravent l'identificationfication des composants ECM rares. Cela est particulièrement important dans le tissu cardiaque, dans lequel les protéines mitochondriales et myofilament représentent une proportion importante de la teneur en protéines 7. D'autre part, les protéines ECM intégrales sont fortement réticulé et difficile à solubiliser. Enfin, la présence de PTM abondantes ( par exemple, glycosylation) modifie la masse moléculaire, la charge et les propriétés électrophorétiques des peptides, affectant à la fois la séparation et l'identification par spectrométrie de masse en tandem de chromatographie liquide (LC-MS / MS). Ces dernières années, nous avons développé et amélioré l'extraction séquentielle et la méthode d'enrichissement pour les protéines ECM qui est compatible avec l'analyse par spectrométrie de masse (MS) à la suite. La stratégie est basée sur incubations séquentielle.

La première étape est effectuée avec du NaCl, un tampon ionique qui facilite l'extraction des protéines ECM ECM associé et faiblement liée, ainsi que des protéines nouvellement synthétisées ECM. il is détergent libre, non dénaturant, sans perturbation des membranes cellulaires, et prête pour d' autres tests biochimiques 8. Ensuite, la décellularisation est réalisée avec du dodécylsulfate de sodium (SDS). A ce stade, une faible concentration en SDS assure la déstabilisation de la membrane et la libération des protéines intracellulaires tout en empêchant la rupture des composants les plus solubles de l'ECM non intégrés. Enfin, les protéines de la MEC sont extraites avec un tampon de chlorhydrate de guanidine (GuHCl). GuHCl est efficace pour l' extraction des protéines fortement réticulée et les protéoglycanes de tissus tels que les tendons, le cartilage 10 9, les vaisseaux 11, 12, 13 et le coeur 2, 3. Nous avons appliqué ce fractionnement biochimique, en combinaison avec LC-MS / MS, pour explorer le remodelage de l' ECM dans les maladies cardiovasculaires 2 <sup>, 3, 11, 12, 13, 14. Les progrès récents dans la SEP comprennent de nouvelles méthodes de fragmentation, telles que des combinaisons de dissociation de collision énergie plus élevée (HCD) et de dissociation de transfert d'électrons (ETD), qui permettent l'analyse directe des glycopeptides intacts 3, 15.

Nous décrivons ici une méthode pour préparer ECM pour l'analyse MS qui permet l'analyse de la composition des protéines, l'identification des sites de glycosylation et la caractérisation des formes glycanniques. Par rapport aux analyses précédentes de l' ECM 16 glycosylation, cette méthodologie permet l'évaluation directe des changements dans la composition des profils de glycosylation d'une manière spécifique à un site en utilisant MS. Nous avons appliqué cette méthode aux tissus cardiovasculaires. Cependant, il peut aldonc être appliqué, avec des modifications mineures, à l'étude de l'ECM dans d'autres échantillons de tissus et peuvent fournir des informations sans précédent sur la biologie de l'ECM.

Protocol

L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la recherche locale Wandsworth (numéro de référence: 06 / Q0803 / 37) et a reçu l'approbation institutionnelle du bureau de recherche et développement. Tous les patients ont signé un consentement éclairé. 1. Extraction des protéines de la matrice extracellulaire NOTE: Les tissus auriculaires humains utilisés pour ces expériences ont été obtenues à partir des auricules pendant la circulation extracorporelle, juste après l'arrêt cardioplégique du cœur. Tous les échantillons ont été prélevés à l'hôpital St George, Londres, Royaume-Uni. Tous les échantillons de tissus doivent être congelés à -80 ° C. Ne pas utiliser des échantillons conservés avec fixateurs, tels que paraformaldéhyde, que les protéines réticuler. Préparer tous les tampons d'extraction à l' avance d'expériences, selon le tableau 1, afin de minimiser le temps entre les étapes d'extraction. Effectuer toutes les incubations à la température ambiante (RT) dans un environnement à température contrôlée( À savoir environ 20 ° C) afin d' assurer la cohérence entre les extractions. Peser 20 à 50 mg de tissu. Si vous souhaitez extraire plusieurs échantillons, couper et peser un par un pour éviter la décongélation complète des tissus. En utilisant un scalpel, dés le tissu en 3-4 morceaux plus petits ( par exemple, 2-3 mm) et de les placer ensemble dans des tubes de 1,5 ml. Ajouter 500 ul de solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS, voir le tableau 1 et le tableau des matériaux) et effectuer cinq lavages pour minimiser la contamination du sang. Extraction Etape 1: Incubation avec du NaCl Tampon Après lavage avec du PBS, placer les échantillons dans des tubes de 1,5 mL avec bouchons à vis. Ajouter tampon NaCl (voir le tableau 1) à 10 fois (v: w) le poids du tissu. Vortex les tubes à température ambiante pendant 1 h à la vitesse minimale ( par exemple, 600 rpm). Remarque: Une faible vitesse de tourbillon est essentielle pour éviter la rupture mécanique du tissu au cours de cette étape.Utiliser un adaptateur de mousse pour placer tous les tubes au cours de l'extraction. Transférer les extraits dans de nouveaux tubes et centrifuger à 16 000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Conserver les extraits à -20 ° C jusqu'à utilisation. Laver brièvement les pastilles de tissu restant avec du tampon NaCl frais. Utiliser le même type de tampon ( par exemple, 100 ul de tampon NaCl) pour le lavage afin d' empêcher l'extraction d'autres protéines ayant des solubilités différentes ( par exemple, des protéines non extractibles avec du NaCl). Après lavage, d'assurer l'élimination complète de la mémoire tampon pour minimiser le chevauchement de la teneur en protéine avec des étapes d'extraction suivantes. Jeter le tampon NaCl utilisée pour le lavage. NOTE: Le rapport entre le volume tampon et le poids du tissu est important pour une extraction reproductible. Un rapport 10: 1 (v: w) pour les extractions de NaCl et du SDS et 5: 1 pour l'étape GuHCl fournir des quantités suffisantes de protéine sans saturer la mémoire tampon. Les concentrations en protéines sont d'environ 1 à 2 pg / pl après extraction. Extraction Étape 2: décellularisation avec SDS Tampon Ajouter du tampon SDS (tableau 1) à dix fois (v: w) le poids du tissu; l'utilisation de faibles concentrations de SDS ( par exemple, 0,1%) est indispensable pour éviter la perte de protéines de la MEC pendant décellularisation. Vortex les tubes à température ambiante pendant 16 h à la vitesse minimale ( par exemple, 600 rpm). NOTE: Une faible vitesse de vortex minimise la rupture mécanique de l'ECM. Transférer les extraits de nouveaux tubes. Centrifuger à 16 000 xg pendant 10 min à 4 ° C; stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation. Laver brièvement les pastilles de tissu restant avec dd H 2 O pour éliminer le SDS. Assurer l'élimination complète du liquide après le lavage. Extraction Étape 3: L' incubation avec GuHCl tampon Ajouter tampon GuHCl (tableau 1) à cinq fois (v: v) le poids du tissu. Vortex les tubes à température ambiante pendant 72 h à la vitesse maximale ( par exemple, </em> 3.200 tours par minute); tourbillonner vigoureuse facilite la rupture mécanique de l'ECM. Transférer les extraits de nouveaux tubes. Centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. 2. Protéines Quantification et des précipitations Remarque: En raison de la présence de détergents, le tampon SDS est incompatible avec la quantification de la protéine directement à partir de mesures d'absorbance à 280 nm. Pour assurer la quantification reproductible, utiliser des tests colorimétriques pour tous les extraits de protéines 17. Quantification. Préparer des normes pour une courbe d'étalonnage utilisant de l' albumine de sérum bovin (BSA) dilué en série dans le tampon d'extraction approprié ( par exemple, NaCl, SDS, ou GuHCl) 17. Pendant ce temps, les dégeler des extraits d'échantillons. Diluer les échantillons dans un tampon d'extraction pour obtenir des concentrations à l'intérieurla plage linéaire de l'absorbance; une dilution 1:10 (v: v) donne des résultats satisfaisants. Diluer les échantillons GuHCl avec une quantité égale de ddH 2 O pour la quantification, selon le test colorimétrique est pas compatible avec les concentrations de> 4 M GuHCl. Utiliser un acide bicinchoninique (BCA) à base de 17 dosage colorimétrique (voir le tableau des matériaux), en suivant les instructions du fabricant pour les dosages dans des plaques à 96 puits; il est recommandé d'effectuer des mesures au moins en double. Après incubation pendant 30 min, prendre des lectures d' absorbance à une longueur d'onde de 570 nm pour calculer la concentration en protéines en utilisant la courbe d'étalonnage standard BSA 17. Précipitations protéines Décongeler GuHCl extrait à la température ambiante. Aliquote de 10 pg de protéines pour chaque échantillon dans de nouveaux tubes. Pour une analyse de glycopeptides directe, aliquote de 50 pg. Ajouter 10 fois le volume d'éthanol et incubate pendant une nuit à -20 ° C. REMARQUE: GuHCl est pas compatible avec d'autres réactions enzymatiques et la plupart des applications électrophorétiques. La suppression de GuHCl est nécessaire avant déglycosylation et la digestion trypsine. La solubilité du GuHCl dans l' éthanol et, à l' inverse, la faible solubilité des protéines permettent l'élimination efficace de GuHCl tout en donnant environ une récupération de 98% des protéines 18. Centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 30 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. Prenez soin de ne pas perturber le culot précipité. Sécher les granulés à 15 min en utilisant un concentrateur sous vide (voir le tableau des matériaux) à température ambiante. REMARQUE: Le protocole peut être arrêté ici et les granulés séchés conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation. Eventuellement, exécuter une électrophorèse sur gel en tant que contrôle de qualité (QC, voir les méthodes supplémentaires). 3. séquentielle déglycosylation pour laÉvaluation de la N-glycosylation occupation du site Pendant le séchage de l' échantillon (voir étape 2.2.2), préparer le tampon de déglycosylation contenant déramification enzymes de déglycosylation, selon le tableau 1. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur ce produit. Ajouter 10 uL de tampon de déglycosylation contenant des enzymes à chaque échantillon. Assurer la remise en suspension de granulés appropriée en effectuant un tourbillon rapide et spin-down des échantillons. NOTE: L'élimination des monomères de sucres en utilisant des enzymes de débranchement est essentiel pour l'élimination subséquente et complète de saccharides complexes liés par O et facilite le clivage par la suite des sucres N-liés par la PNGase-F. Incuber pendant 2 heures à 25 ° C pour permettre l'élimination du sulfate d'héparane par l'héparinase II.Increase la température à 37 ° C et incuber pendant 36 h sous agitation douce. NOTE: En raison des faibles volumes de réaction et des temps d'incubation prolongée, shakers incubateur d'utilisation et rappr plusieurs bain 1,5 mles dans un tube conique de 50 ml appuyé à l'intérieur de l'incubateur à environ 45 °. Après 36 h, centrifuger les échantillons pendant 1 min à 16 000 xg et évaporer le H 2 O à partir des échantillons en utilisant un concentrateur sous vide à température ambiante pendant environ 45 min. Remettre en suspension les échantillons séchés avec 10 ul de H 2 18 O contenant 50 U / ml PNGase-F, qui clive tous les glycanes liés à l' asparagine dans une réaction de désamidation. NOTE: L'acide aspartique résultant porte une masse supérieure à 2,98 Da, indiquant la présence de N-glycosylation au cours de l'analyse MS. Incuber pendant 36 heures à 37 ° C sous agitation constante dans un agitateur incubateur. 4. En solution Trypsine Digestion REMARQUE: Cette étape doit être effectuée pour les deux non-déglycosylée ( par exemple, utilisés pour l' analyse des glycopeptides directe) et des échantillons déglycosylées (c. -à- utilisés pour l'évaluation des glycanes occupancy). Utiliser 10 ug de protéine totale pour l'évaluation de l'occupation des sites de N-glycosylation (comme indiqué dans l'étape précédente). Pour les échantillons destinés à l'analyse des glycopeptides directe, en utilisant 50 ug de protéine telle que la quantité de départ. REMARQUE: Les étapes suivantes sont décrites pour 10 ug de protéine. Intensifier e evolumes ( à savoir, 5 fois pour 50 ug) selon les besoins. Dénaturer les protéines de chaque fraction aliquote de l' échantillon au moyen d' urée 9 M et 3 M thiourée, avec des concentrations finales de 6 M d' urée et de la thiourée 2 M, respectivement (par exemple, pour un échantillon de 10 ul, 20 ul d'urée / thiourée). Réduire les protéines par addition de 100 mM de dithiothréitol (DTT, 3,33 uL, concentration finale: 10 mM). Incuber à 37 ° C pendant 1 h sous agitation à 240 tours par minute. Refroidir les échantillons à température ambiante avant d'effectuer l'alkylation en ajoutant 0,5 M d'iodoacétamide (3,7 uL, concentration finale: 50 mM). Incuber dans l'obscurité pendant 1 h. Utilisez prérefroidi (-20° C) de l'acétone (6 fois le volume de l'échantillon) à incuber les échantillons pendant une nuit à -20 ° C. Précipiter par centrifugation à 14 000 xg pendant 25 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant. Prenez soin de ne pas perturber le culot précipité. Sécher les granules de protéines en utilisant un concentrateur sous vide pendant 30 min à température ambiante. Remettre en suspension dans 20 ul de 0,1 M de tampon bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), pH 8,2, contenant de la trypsine (0,01 pg / ul) et de digérer pendant une nuit à 37 ° C et 240 tours par minute. Arrêter la digestion par acidification des échantillons avec 10% d'acide trifluoroacétique (TFA, 2 ul pour une concentration finale de 1% de TFA). 5. Nettoyage Peptide Utilisation de colonnes C18 NOTE: L'élimination des contaminants d'interférence à partir du mélange de peptides après digestion réduit ion suppression et améliore le rapport signal à bruit et de la couverture de séquence. Cette étape doit être effectuée pour les deux sa non déglycosylée et déglycosyléemples. Activer la résine sur la plaque de rotation de C18 (voir le tableau des matériaux) en utilisant 200 ul de methanol par puits et centrifuger à 1000 g pendant 1 min. Laver par addition de 200 ul par puits de 80% d' acétonitrile (ACN) et 0,1% de TFA dans H 2 O. Centrifuger à 1000 g pendant 1 min. Equilibrer par addition de 200 ul par puits de 1% d' ACN et 0,1% de TFA dans H 2 O. Centrifuger à 1000 g pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois. Charger les échantillons (volume total) de l'étape 4 dans les puits contenant la résine et centrifuger à 1500 g pendant 1 min. Recharger le flux à travers une deuxième fois et répéter la centrifugation. Laver par addition de 200 ul par puits de 1% d' ACN et 0,1% de TFA dans H 2 O. Centrifuger à 1500 g pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois. Éluer les échantillons avec 170 ul par puits de 50% d' ACN, 0,1% de TFA dans H 2 O. Centrifuger à 1500 g pendant 1 min. Répétez l'étape précédenteet combiner l'éluat recueilli. Sécher l'éluat en utilisant un concentrateur sous vide pendant 2 h à température ambiante. Si ce n'est pas utilisé immédiatement, conserver les échantillons séchés à -80 ° C jusqu'à utilisation. NOTE: Les échantillons déglycosylée destinés à l'identification des protéines ne sont prêts à l'emploi pour LC-MS / MS après cette étape. Les étapes 6 et 7 ne sont pas requis pour ces échantillons. Décongeler et remettre en suspension les échantillons dans déglycosylées 2% d' ACN et 0,05% de TFA dans H 2 O à une concentration de protéine finale de 0,5 pg / pl. Procéder à l'étape 6 pour l'analyse directe d'échantillons glycopeptide non déglycosylées. Eventuellement, filtrer les peptides avant marquage avec des marqueurs de masse en tandem (TMT); voir les méthodes supplémentaires pour fitration peptide. 6. Identification avec TMT (pour Direct glycopeptides Analyse uniquement) Décongeler et remettre en suspension les pastilles séchées dans 50 pl de 50 mM TEAB pour obtenir une concentration de 1 ug / ul. Resusped le flacon de 0,8 mg de TMT zéro (TMT 0, voir le tableau des matériaux) dans 41 ul de réactif d'ACN. Suivez les recommendantions du fabricant pour la remise en suspension. Étiqueter les échantillons de peptides à un rapport de 50 ug à 0,4 mg des peptides TMT 0 ( à savoir, 50 ul de peptides à 20,5 ul de TMT 0). Incuber à température ambiante pendant 1 h. Stopper la réaction de marquage en ajoutant 5% d' hydroxylamine dans un rapport 6: 100 ( à savoir, 4,23 ul de 5% d' hydroxylamine). Incuber à température ambiante pendant 15 min. Sécher les échantillons de peptides TMT 0 marqués au pendant 1 h à la température ambiante en utilisant un concentrateur sous vide. Remettre en suspension dans 10 pl de ddH 2 O. NOTE: En raison des résidus glycanniques, glycopeptides afficher une masse moléculaire supérieure à celle des peptides non glycosylés. TMT 0 augmente l'état de charge de glycopeptides. Cela réduit leur masse par rapport à facturera rapports (m / z) et facilite la fragmentation ETD. 7. glycopeptides enrichissement Utiliser des tampons de réaction fournis dans le kit (voir le tableau des matériaux). Ajouter 50 uL de tampon de liaison à chaque échantillon de 10 ul de l'étape 6.5. Vortexer la solution de résine de glycocapture jusqu'à ce qu'il devienne homogène. Utiliser une chromatographie en phase liquide d'interaction hydrophile zwitterionique (ZIC-HILIC) à base de 15 capture. Aliquote de 50 ul de la suspension de résine dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Faites tourner pendant 1 min à 2500 xg et éliminer le surnageant. Ajouter 60 pi d'échantillon ( par exemple, l'échantillon avec un tampon de liaison) sur les tubes contenant les pastilles de résine. Mélanger à l'aide d'une pipette et incuber à température ambiante pendant 20 min en agitant à 1200 tours par minute. Centrifuger pendant 2 min à 2000 xg et transférer le surnageant dans de nouveaux tubes. Gardez les tubes. Ajouter 150 ul de tampon de lavage aux tubes de résine. Mélanger à l'aide d'une pipette et incuber à température ambiante pendant 10 min en agitant à 1200 tours par minute. Spin pendant 2 min à 2500 x g. Transfertle surnageant dans les mêmes tubes de l'étape (7.4). Répétez les étapes de lavage, deux fois. Ajouter 75 ul de tampon d'élution et mélanger à l'aide d'une pipette. Agiter à 1200 rpm pendant 5 min à température ambiante puis centrifuger les tubes pendant 2 minutes à 2500 x g. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 ml. Répétez les étapes de lavage, puis transférer le surnageant éluat dans le même tube. Centrifuger les tubes contenant l'éluat (c. -à- glycopeptides) pendant 2 min à 2500 x g. Transférer le surnageant dans des tubes neufs pour assurer l'élimination de toute résine restant dans les étapes précédentes. Sécher les total 150 ul d'éluat en utilisant un concentrateur sous vide pendant environ 2 h à température ambiante. Resuspendre les glycopeptides-down séché dans 15 ul de 2% d' ACN et 0,05% de TFA dans ddH 2 O. Passez à effectuer LC-MS / MS en utilisant la fragmentation de HCD pour analyser la composition des protéines ECM et LC-MS / MS en utilisant HCD et la fragmentation ETD pour la caractérisation des glycopeptides. Voir la section 8. </ol> 8. Analyse de spectrométrie de masse Effectuer LC-MS / MS en utilisant la fragmentation de HCD pour analyser la composition des protéines ECM; voir les méthodes supplémentaires pour plus de détails. Effectuer LC-MS / MS en utilisant HCD et la fragmentation ETD pour la caractérisation des glycopeptides (voir les méthodes supplémentaires pour plus de détails); l'échantillon enrichi doit être comparée à la matière d'entrée non enrichi 15. NOTE: Une description détaillée des méthodes LC-MS / MS pour l'analyse des glycopeptides indirecte, l'analyse des glycopeptides directe, et la recherche de base de données sont fournies dans les méthodes supplémentaires. Les chercheurs intéressés à la caractérisation des protéines ECM et la composition glycanes par spectrométrie de masse sont invités à consulter les publications précédentes 3, 11, 15.

Representative Results

Un flux de travail schématique du protocole est fourni à la figure 1. protocole d'extraction de l'ECM L'efficacité de l'extraction peut être suivie par l'exécution des aliquotes forment chaque extrait sur des gels d'acrylamide Bis-Tris et en utilisant une coloration d'argent pour la visualisation. La figure 2A montre la complémentarité du NaCl, du SDS et extrait GuHCl après extraction séquentielle. Ce QC permet d'identifier des problèmes potentiels avec la qualité des échantillons tels que la dégradation excessive de protéines. Après extraction, les glycoprotéines de l' ECM sont abondants dans les extraits GuHCl (figure 2B). déglycosylation Pour évaluer l'efficacité de déglycosylation, un contrôle non déglycosylée doit être exécuté en parallel. Déglycosylation fois doivent être appropriés pour obtenir une élimination complète et homogène des résidus de sucre, comme illustré sur la figure 3A. La figure 3B montre un exemple représentatif d'échantillons de manière efficace déglycosylées par l'addition d'enzymes pour l' élimination des GAG et des enzymes déglycosylation qui ciblent les petits oligosaccharides N- et O-liés. glycoprotéomique Le protocole d'évaluation de l'occupation de NxT / S sequons améliore la couverture de la séquence protéique pour les glycoprotéines de l' ECM après MS (Figure 3C) et permet un criblage initial de la présence de glycoprotéines. Cela permet de réduire le temps de recherche de glycopeptides, les bases de données peuvent être personnalisés pour contenir des glycoprotéines précédemment identifiés. fragmentation HCD-ETD est utilisé pour l'identification et la caractérisation de la composition d'oligosaccharides attachés à ECM g lycoproteins. La figure 4A montre un spectre représentatif obtenu pour un peptide marqué avec 18 O après déglycosylation (analyse de glycopeptide indirect). La figure 4B est un exemple représentatif d'un spectre obtenu après l' analyse des glycopeptides intacts à partir d' extraits de l' ECM (analyse de glycopeptide directe). Figure 1: Vue d' ensemble Méthode. (A) Après enrichissement séquentiel pour les protéines de la MEC, les analyses LC-MS / MS sont effectuées sur des extraits déglycosylées. (B) En variante, non déglycosylées extraits ECM sont en outre enrichies en glycopeptides. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 2" src = "/ files / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg" /> Figure 2: Extraction des protéines ECM. (A) Les 3 extraits différents de la procédure d'extraction séquentielle ( « Quickstep anglais ») sont complémentaires dans leur teneur en protéines. Alors que les extraits SDS sont enrichis en protéines intracellulaires, extraits GuHCl contiennent la majorité des protéines ECM. fractionnement réussie est visualisé par l'autre motif de coloration à l'argent. (B) des protéines de la MEC telle que la petite protéoglycanes riches en leucine décorine, le biglycane et mimecan sont détectés principalement dans les extraits GuHCl, avec peu de présence dans les extraits SDS et du NaCl. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3. Analyse des Glycosylation. (A) des durées d'incubation appropriées sont nécessaires pour la déglycosylation complète. L'exemple montre l'effet du temps d'incubation lors de l'enlèvement des chaînes de glycosaminoglycane à partir de la décorine glycoprotéine. (B) des glycoprotéines de l' ECM sont décorées avec des chaînes glycosaminoglycane grandes et répétitives et N- court et diversifiés , et des oligosaccharides O-liés. Lane 1 sur chacune des immunoblots représente extraits cardiaques non traités. La piste 2 contient des extraits traités avec des enzymes qui digèrent les glycosaminoglycanes. Les échantillons dans la piste 3 contiennent, en outre, les enzymes pour l'élimination des oligossacharides liés à O et N-. La galectine-1 est pas glycosylée, par conséquent, il n'y a pas de changement dans la taille de la protéine. Adapté de Lynch M, et al. 4 (C) dans l' analyse LC-MS / MS, les échantillons traités avec la PNGase-F en présence de H 2 18 O obtenir une meilleure couverture de séquence (%, sur le côté droit) par rapport aux échantillons non déglycosylées. réarche espaces verts représentent la couverture de séquence par LC-MS / MS. Les lignes en pointillés représentent rouges, glycosites, avec un nombre indiquant la position d'acide aminé. La détection de glycosylation de décorine à la position Asn 211 (N, mis en évidence en gras) est représenté en détail à titre d'exemple à la figure 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4. Analyse glycopeptides par MS. (A) En utilisant une approche protéomique fusil de chasse sur les extraits enrichis ECM, glycopeptides peuvent être identifiés par la présence de asparagine déamidées dans sequons NxT / S et étiquetés avec 18 O. L'exemple montre un spectre HCD MS / MS pour un peptide de décorine contenant le glycosylée précédemment Asn 211. Les données obtenues peuvent être utiliséespour créer une base de données personnalisée de glycoprotéines ECM. (B) la fragmentation HCD-ETD est utilisé pour analyser l'extrait d'ECM enrichi glycopeptidique. Le spectre ETD MS / MS permet la caractérisation de la composition glycanes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. A. solutions Stock DTT (Dithiotreitol, C 4 H 10 O 2 S 2) 100 mM de DTT dans ddH 2 O. 1 EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique, C 10 H 16 N 2 O 8) 250 mM d' EDTA dans ddH 2 O, pH 8,0. GuHCl (chlorhydrate de guanidine, CH 6 ClN 3) 8 M GuHCl enddH 2 O. IAA (iodoacétamide, C 2 H 4 INO) 500 mM IAA dans ddH 2 O. 1,2 Na acétate (acétate de sodium, C 2 H 3 NaO 2) 1 M d' acétate de Na 2 O dans ddH, pH 5,8. NaCl (chlorure de sodium, NaCl) 1 M de NaCl dans ddH 2 O. Na dibasique de phosphate (phosphate disodique, Na 2 H 2 PO 4) 1 M de phosphate de sodium dibasique jj H 2 O, pH 6,8. SDS (dodécylsulfate de sodium, NaCl 12 H 25 SO 4) 1% de SDS (35 mM) dans ddH 2 O. 3 TFA (acide trifluoroacétique, C 2 HF 3 O 2) 10% de TFA (1,2 M) dans ddH 2 O. TEAB (bicarbonate de triéthylammonium, C 7 H 17 </sub> NO 3) 1 M TEAB en en ddH2O, pH 8,5 Thiourée (thiourée, CH 4 N 2 S) 3 M thiourée dans ddH 2 O. Tris-HCl (Tris-chlorhydrate de (NH 4 O 11 C 3 [HCl]) 100 mM de Tris-HCl à ddH 2 O, pH 7,5. Urée (Urea, CH 4 N 2 O) 9 M d' urée dans ddH 2 O. B. tampons de réaction C18 tampon d'équilibrage de nettoyage 1% d' ACN, 0,1% de TFA dans ddH 2 O C18 tampon de lavage de la colonne de nettoyage 80% d' ACN, 0,1% de TFA dans H 2 O C18 tampon d'élution de nettoyage 50% d' acétonitrile, 0,1% de TFA dans ddH 2 O Déglycosylation Tampon (4x) 600 mM NaCl et 200 mM de phosphate de Na 2 O dans ddH, pH 6,8. Tampon GuHCl 4 4 M de chlorhydrate de guanidine, l' acétate de Na 50 mM et 25 mM d' EDTA dans ddH 2 O, pH 5,8. Ajouter 1: 100 (v: v) de cocktail d'inhibiteurs de protéinase avant utilisation. Tampon NaCl 4 0,5 M de NaCl, 10 mM de Tris-HCl et 25 mM d' EDTA dans ddH 2 O, pH 7,5. Ajouter 1: 100 (v: v) de cocktail d'inhibiteurs de protéinase avant utilisation. PBS (1x) 1,7 mM KH 2 PO 4, 5 mM de Na 2 HPO 4, 150 mM de NaCl, pH 7,4. Ajouter 25 mM d'EDTA et 1: 100 (v: v) de cocktail d'inhibiteurs de proteinases avant utilisation. un tampon d'échantillon (4x) 100 mM de Tris, 2% de SDS, 40% de glycerol, 0,02% de bleu de bromophénol dans ddH 2 O, pH 6,8. Ajouter 10% ß-mercaptoéthanol avant utilisation. Tampon SDS 4 0,1% de SDS et 25 mM d' EDTA dans ddH 2 O. Ajouter 1: 100 (v: v) de cocktail d'inhibiteurs de proteinases befl'utilisation du minerai. C. enzymes Chondroïtinase ABC 5 0,5 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) kératanase 5 0,1 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) Héparinase II 5 0,1 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) α2-3,6,8,9-neuraminidase (sialidase) 5 0,025 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) β1,4-galactosidase 5 0,015 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) ß-N-acétylglucosaminidase 5 0,25 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) Endo-α-N-acétylgalactosaminidase (O-glycosidase) 5 0,013 U / ml dans le tampon de déglycosylation (1x) PNGase-F (N-glycosidase-F) 6 50 U / ml dans H 2 O 18 trypsine 0,01 ug / ul dans du tampon TEAB Tableau NOTES. 1 Conserver la solution de stock congelé à -20 ° C. 2 IAA doit être conservé à l' abri de la lumière. 3 SDS cristallise facilement à <20 ° C. Afin de faciliter la solubilisation du SDS à 1% (solution mère), réchauffer le tampon sous l'eau chaude du robinet. 4 tampons d' extraction peuvent être stockés à température ambiante. Ajouter un cocktail à large spectre d'inhibiteurs de protéinase comme indiqué avant l'utilisation. 5 Ces enzymes doivent être ajoutés au cours de la première étape de déglycosylation. 6 PNGase-F doit être ajouté seulement au cours de la deuxième étape de déglycosylation. </td> Tableau 1: Solutions mères, tampons de réaction et d' enzymes. Ce tableau présente la composition de chaque solution mère et un tampon réactionnel requis pour l'extraction et le traitement ultérieur (y compris les digestions enzymatiques) de protéines d'ECM cardiaques avant l'analyse MS.

Discussion

Ce protocole a été optimisé protéomique au cours des dernières années dans notre laboratoire. Ici, nous avons utilisé le tissu cardiaque, mais seulement des ajustements mineurs peuvent être nécessaires pour son application à d'autres tissus. Par exemple, le protocole d'extraction doit prendre la cellularité du tissu en considération. tissu cardiaque est très cellulaire par rapport au tissu vasculaire. Lors de l' utilisation du tissu vasculaire, la concentration de SDS peut être plus faible (soit 0,08%) et le temps de décellularisation est plus court (c. -à- 4 h) 11, 12, 13. L'utilisation d'enzymes de déglycosylation est crucial pour l'analyse LC-MS / MS de composition ECM. Cependant, les temps d'incubation doivent être ajustées pour différents types de tissus. Par exemple, l' héparinase II durées d'incubation prolongées requises à 25 ° C lors de l' utilisation des échantillons tels que la peau, qui sont riches en protéines de la membrane basale (par exemple , l' agrine, le perlecan) (données non présentées). L' analyse directe des glycopeptides peut être effectuée sur un milieu conditionné à partir de cellules en culture 15. les étapes d'enrichissement ne peuvent pas être nécessaires à l'analyse de cette subproteome simplifiée. Extraits similaires à GuHCl, extraits de NaCl sont également prête pour l'analyse des glycoprotéomique avec des modifications mineures. D' autres protocoles d'extraction pour l' enrichissement de protéines d'ECM peuvent être adaptées pour caractériser ECM glycopeptides 19, 20.

Est le PTM glycosylation plus complexe 5. Identification indirecte des glycopeptides est réalisée par la détection de désamidée Asn avec 18 incorporé à une O NxT / S séquon. Désamidée Asn à d'autres positions peuvent représenter des faux positifs. De même, la N-glycosylation doit être considérée dans le contexte des ontologies de protéines: les protéines intracellulaires contenant un séquon NxT / S ne seront pas glycosylée mais pourraient donner lieu à des faux positifs. Comme searc courantLes algorithmes de h ne permettent pas pour le criblage de PTM à des séquences prédéterminées ( à savoir Asn à NxT / S), le filtrage manuel des données est nécessaire. Identification de la présence / absence de glycosylation au niveau de ces positions peuvent être comparées entre les échantillons de la maladie et de contrôle. Il n'y a pas d' équivalent de l' enzyme de PNGase F pour O-déglycosylation (c. -à introduire un décalage de masse sur la thréonine ou la sérine). Par conséquent, l'identification de O-glycosylation est limitée à l'analyse des glycopeptides directe. L'analyse directe des glycopeptides est utilisée pour obtenir des informations de composition des sucres attachés aux protéines, mais ne fournit pas d'information structurelle des glycanes. En outre, la composition glycane est le résultat de la synthèse et le traitement des glycanes après la sécrétion.

Notre méthode d'extraction en 3 étapes pour les protéines ECM ( « anglais Quickstep ») 6 a permis la caractérisation de l'ECM dans une variété de tissus cardiovasculaires. Fractionnement du tissuen plusieurs extraits est nécessaire pour obtenir un protéome ECM simplifié tel que discuté ailleurs 6. protéines intracellulaires seraient autrement contribuer à une dynamique excessive des abondances de protéines dans les extraits qui entraveraient l'identification des protéines ECM moins abondantes. De plus, les protéines intracellulaires portent O-glycosylations 5 qui compliqueraient l' enrichissement de l' ECM glycopeptidique et analyse ultérieure MS. D' autres auteurs ont appliqué des méthodes d'extraction similaires pour caractériser par exemple 21 poumon et les tissus du cartilage 10, mais ils n'ont pas poursuivi l'analyse de glycosylation. Une analyse antérieure de glycosylation a porté sur l' identification des glycosites seulement, exigent le retrait de la glycane à partir du noyau de protéines, et ne peut pas évaluer O-glycosylation 22, 23. tableaux lectine et l'enrichissement chimique sont disponibles pour l'évaluation des typ glycaneses sur des échantillons biologiques en fonction de leur spécificité de liaison, mais ces techniques ne peuvent pas attribuer des types glycanes à des protéines spécifiques 24 ils ne peuvent pas évaluer les sites de glycosylation.

Dans un premier temps, nous avons utilisé l'électrophorèse sur gel avant LC-MS / MS de protéines ECM. Bien que la séparation de gel est utile pour obtenir des fractions protéiques simplifiées prêtant à une analyse LC-MS / MS, les derniers instruments offrent des vitesses de balayage plus rapides. Ainsi, on peut omettre l'étape de séparation électrophorétique. Cela offre un avantage supplémentaire que de grandes protéines ECM, qui sont conservés au-dessus du gel, sont analysés de manière plus efficace. Toutefois, les informations concernant la Mw des protéines intactes est perdue. L'étape d'évaporation avant PNGase F déglycosylation assure l' élimination complète de H 2 O régulier pour réduire au minimum les faux négatifs. Résidus de sucre ( à savoir des masses variables glycane) interfèrent avec la séparation par LC et compromettent l' identification du peptide ultérieur par MS / MS. Un pun protocole-déglycosylation est également recommandé pour l'analyse protéomique des protéines ECM ne porte pas sur la glycosylation.

Proteomics peuvent fournir des informations sans précédent dans l'ECM. Au – delà de support structurel, les glycanes attachés à l'ECM sont essentiels pour l' interaction hôte-pathogène, la communication cellule-cellule et la réponse immunitaire 25, à savoir le rejet d'allogreffe après transplantation d'organes. Glycoprotéomique sera un outil essentiel dans glycobiology.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JBB est un établissement de carrière Fellow au British Heart Foundation Centre du Roi. MM est Senior Fellow de la British Heart Foundation (FS / 13 / 2/29892). L'étude a été soutenue par une initiative d'excellence (centres de compétence pour une technologie d'excellence – COMET) de l'Agence pour la promotion de la recherche autrichienne FFG: « Centre d'excellence en recherche en Vascular vieillissement – Tyrol, VASCage » (nombre K-projet 843536) et la NIHR recherche biomédicale centre basé à la Fondation nationale des services de santé de Guy et Saint-Thomas et confiance king College de Londres en partenariat avec College Hospital king.

Materials

A. Chemicals
Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) Thermo Scientific 51101 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4
Cocktail of proteinase inhibitors Sigma-Aldrich P8340 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Disodium phosphate (Na2H2PO4) Sigma-Aldrich S7907 3.1
Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) Sigma-Aldrich D0632 4.3
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) Sigma-Aldrich E9884 1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Ethanol (C2H6O) VWR 437433T 2.2.1
Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) Sigma-Aldrich G3272 1.6.1
Glycerol (C3H8O3) Acros organics 158920025 Suppl 1.1
H2O LC-MS Cromasolv Sigma-Aldrich 39253-1L-R Throughout the protocol
H218O Taiyo Nippon Sanso FO3-0027 3.5
Hydroxylamine (HA, H3NO) Sigma-Aldrich 467804 6.4
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) Sigma-Aldrich A3221 4.4
Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X Lonza 51226 1.3
Sodium acetate (C2H3NaO2) Sigma-Aldrich S7545 1.6.1
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 1.4.1, 3.2
Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) Sigma-Aldrich 466143 1.5.1
Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) Sigma-Aldrich 11268 4.7, 6.1
Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) Sigma-Aldrich T62200 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3
Thiourea (CH4N2S) Sigma-Aldrich T8656 4.2
Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) Sigma-Aldrich T3253 1.4.1, Suppl 1.
Urea (CH4N2O) Sigma-Aldrich U1250 4.2
Name Company Catalog Number コメント
B. Enzymes
α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) EDM Millipore 362280 (KP0012) 3.1
β1,4-Galactosidase EDM Millipore 362280 (KP0004) 3.1
β-N-Acetylglucosaminidase EDM Millipore 362280 (KP0013) 3.1
Chondroitinase ABC Sigma-Aldrich C3667 3.1
Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) EDM Millipore 362280 (KP0011) 3.1
Heparinase II Sigma-Aldrich H6512 3.1
Keratanase Sigma-Aldrich G6920 3.1
PNGase-F (N-Glycosidase F) EDM Millipore 362280 (KP0001) 3.5
Trypsin Thermo Scientific 90057 4.7
Name Company Catalog Number コメント
C. Reagent kits
30 kDa MWCO spin filters  Amicon, Millipore 10256744 5.9, Suppl 2
Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate Harvard Apparatus 74-5657 5.1
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels Thermo-Scientific NP0322PK2 Suppl 1
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23227 2.1.3
ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit Merk Millipore 72103 7
Tandem mass tag 0 (TMT0) Thermo Scientific 900067 6.2, 6.3
Name Company Catalog Number コメント
D. Equipment and software
Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300µm, 5µm, 100Å Thermo Scientific 160454 Suppl 3, 4
Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75µm, 3µm, 100Å Thermo Scientific 164570 Suppl 3
Byonic Search Engine Protein Metrics Version 2.9.30 Suppl 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano Thermo Scientific n/a Suppl 3, 4
EASY-Spray Ion Source  Thermo Scientific ES081 Suppl 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18,  50cm x 75µm, 2μm, 100Å Thermo Scientific ES803 Suppl 4
Mascot Search Engine Matrix Science Version 2.3.01 Suppl 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFADBMBHQ Suppl 4
Proteome Discoverer Software Thermo Scientific Version 2.1.1.21 Suppl 3, 5
Picoview Nanospray Source New Objective 550 Suppl 3
Q Exactive HF Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMBFZ Suppl 3
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific SPD131DDA 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Scaffold Software Proteome Software  Version 4.3.2 Suppl 3
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参考文献

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Barallobre-Barreiro, J., Baig, F., Fava, M., Yin, X., Mayr, M. Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (122), e55674, doi:10.3791/55674 (2017).
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