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Materials
参考文献
生物学

Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

Published: May 01, 2017
doi:
10.3791/55664
, ,
1Department of Cell Biology,Johns Hopkins School of Medicine, 2生化学・分子生物学科,Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 3Solomon H. Snyder Department of Neuroscience,Johns Hopkins School of Medicine

概要

Nós desenvolvemos uma nova técnica de microscopia electrónica, de "flash-e-congelamento", que permite a visualização da dinâmica da membrana com ms resolução temporal. Esta técnica combina a estimulação optogenetic de neurónios com congelamento de alta pressão. Aqui, demonstramos os procedimentos e descrever os protocolos em detalhe.

Abstract

Células mudam constantemente a sua arquitectura membrana e distribuição de proteína, mas que é extremamente difícil de visualizar estes eventos com uma resolução temporal e espacial da ordem dos ms e nm, respectivamente. Nós desenvolvemos uma técnica resolvida no tempo microscopia electrónica, de "flash-e-congelamento", que induz eventos celulares com Optogenetics e visualiza a dinâmica da membrana, resultando por congelação células em pontos de tempo definidos após a estimulação. Para demonstrar esta técnica, que expressa channelrodopsina, um canal de catiões sensível à luz, em neurónios do hipocampo de rato. Um relâmpago de luz estimula a actividade neuronal e induz a libertação de neurotransmissores a partir de terminais sinápticos através da fusão de vesículas sinápticas. A estimulação de neurónios optogenetic é acoplado com o congelamento de alta pressão para seguir alterações morfológicas durante a transmissão sináptica. Usando um instrumento comercial, nós capturamos a fusão das vesículas sinápticas e a recuperação da synamembrana da vesícula PTIC. Para visualizar a sequência de eventos, grandes conjuntos de dados foram gerados e analisados ​​cegamente, uma vez que as alterações morfológicas foram seguidos em células diferentes ao longo do tempo. No entanto, de flash-e-congelamento permite a visualização da dinâmica da membrana em micrografias electrónicas com resolução temporal ms.

Introduction

A visualização dinâmica de membrana e de proteína dentro de uma célula é um passo chave para a compreensão da biologia celular de processos particulares. eventos de tráfico dinâmica pode ser capturado usando microscopia de luz ou fluorescência. No entanto, o contexto subcelular é largamente ausente em tais imagens porque as estruturas subcelulares não pode ser completamente "pintado" por corantes ou sondas fluorescentes e resolvidos espacialmente e espectralmente 1, 2. Por outro lado, enquanto a microscopia eletrônica pode delinear arquitetura subcelular com extraordinário pormenor, não pode capturar a dinâmica celular, porque as amostras devem ser fixados antes da imagem. Assim, normalmente não é suficiente para compreender completamente a dinâmica celular usando apenas uma modalidade de imagem.

Para superar as limitações de microscopia óptica e eletrônica, técnicas de microscopia correlativas foram desenvolvidos. Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica(CLEM) visualiza dinâmica intracelulares usando microscopia de luz e estruturas subcelulares subjacentes com microscopia electrónica. Em CLEM, as células envolvidas em diversos processos, tais como a citocinese e endocitose 3, 4, 5, 6, são vivo-representada por imagem e depois processadas para microscopia electrónica. Embora CLEM captura certos aspectos da dinâmica intracelulares, existem quatro fatores que limitam a utilidade desta abordagem. Em primeiro lugar, a resolução temporal é limitada pela rapidez com que as células podem ser imobilizadas, o que normalmente demora s – min devido à difusão lenta e reacção de fixadores 7. Após a segunda, a arquitetura subcelular é observado facto 8; Assim, as alterações morfológicas dinâmicos não pode ser capturado usando esta abordagem. Em terceiro lugar, as micrografias de fluorescência e de electrões pode não ser precisamente alinhados devido ao tecido shrinkage causada por desidratação durante a preparação de amostras para microscopia electrónica de 9, 10. Em quarto lugar, eventos como citocinese e endocitose não acontecem ao mesmo tempo em todas as células 5, 11, e, portanto, uma célula em particular que está envolvida no evento devem ser identificados a partir de uma grande população de células. Este processo é muitas vezes trabalhosa. Assim, um novo método é necessário para induzir a eventos particulares em cada célula e para capturar a dinâmica celulares resultantes pelo rápido imobilização de células em momentos definidos.

Recentemente, várias ferramentas foram desenvolvidas para induzir particulares dinâmica celular usando a luz (optogenética). Channelrodopsina é um canal de catiões sensível à luz, não-selectivo isolado a partir de Chlamydomonas reinhardtii, 12, 13. Quando channelrodopsina é expressa em neuronal membranas, uma breve flash de luz induz um influxo de iões de sódio em neurónios e dispara uma acção de potencial 14, 15. O potencial de acção propaga-se então nos terminais sinápticos, onde vesículas sinápticas fundem dentro de milissegundos 16, 17, 18 Por isso, channelrodopsina induz actividade neuronal. Para acompanhar a dinâmica da membrana nos terminais sinápticos, neurónios deve ser imobilizada em pontos de tempo definidos após a estimulação com precisão ms.

Para capturar a dinâmica da membrana após a indução de actividade neuronal, que juntamente com a estimulação pela luz de alta pressão de congelação 17, 18, 19. Congelamento de alta pressão permite a imobilização quase instantânea de células com gelo reduzida formação de cristais 20. Cristais de gelo can romper membranas e perturbar a arquitectura subcelular 21. Ao variar os intervalos de tempo entre a estimulação e de congelação, o tráfico de membrana dentro de terminais sinápticos foi capturada após a indução de um potencial de acção.

Aqui, demonstramos procedimentos experimentais utilizando um congelador de alta pressão comercializado que acopla um controlo temporal ms de estimulação luminosa com congelamento de alta pressão. Ao contrário de outros instrumentos que requerem um dispositivo externo para controlar o estímulo de luz e de congelação, a estimulação pela luz está completamente integrado no sistema e este pode ser aplicado com precisão ms 19. Este processo envolve várias etapas. 1) neurónios do hipocampo do rato são cultivados em discos de safira e infectadas com lentivírus transportando um vector de expressão para channelrodopsina 18. 2) Os neurónios são estimulados e congelou-se a pontos de tempo definidos após a estimulação. 3) A água é vitrificados substitutod com um solvente orgânico, enquanto que os lípidos e proteínas são reticuladas por fixadores para preservar a arquitectura intracelular. 4) As amostras estão infiltrados e embebidos em resina epoxi. 5) cortes ultrafinos são recolhidos usando um ultramicrotomo. 6) As lâminas são fotografadas num microscópio electrónico de transmissão. 7) aquisição e análise de imagem são realizados às cegas em relação a pontos de tempo ou genótipos. Dinâmica celular pode ser determinado através da reconstrução de imagens resolvidas no tempo 17, 18. A preparação da amostra (passos 2-5 acima) requer uma semana, mas a análise de imagem posterior requer meses a um ano.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as regras e regulamentos do uso de animais pelos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pela Comissão de animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Johns Hopkins School of Medicine. 1. Isolamento e Cultura do rato neurônios do hipocampo Dissecar córtices de um dia pós-natal 0 – dia 2 (P0 – 2) do cérebro de rato 18. Isolar os astrócitos do córtex. NOTA: O cérebro do rato foi isolado depois da decapitação. Os astrócitos servir como uma camada alimentadora para neurónios do hipocampo. Tratar os córtices com 800 mL de 0,05% Tripsina-EDTA durante 15 minutos a 37 ° C para dissociar os astrócitos. Cultura os astrócitos em um frasco T-75 com 13 mL de DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 0,2% de penicilina-estreptomicina durante uma semana a 37 ° C e 5% de CO 2. Colocar 18 mm pe lamela de vidro um ácido-lavados e esterilizadosr poço de uma placa de 12 poços. Lava-se rapidamente dois discos de safira revestida com carbono de 6 mm em 70% de etanol e coloca-os no topo de cada lamela de vidro. Preparar a solução de poli-D-lisina (PDL) através da mistura de 3 ml de ácido acético 17 nM com 1 mL de colagénio de cauda de rato e 1 mL de PDL (1 mg / mL). Aplicar 200 uL de solução PDL para os discos de safira e lamelas de vidro durante 5 min à TA. Remover a solução de PDL e secar ao ar. Antes da utilização, esterilizar a placa tal como preparado nos passos 1,4-1,6 durante 30 min sob luz ultravioleta. Semente os astrócitos do passo 1.3 em 2 mL de meio DMEM a uma densidade de 5×10 4 culas / po na placa como preparado em passos de 1,4 – 1,6. Crescê-las a 37 ° C e 5% de CO 2 durante uma semana. Adiciona-se 20 mL de f luoro-desoxiuridina (concentração final: 80 uM) a cada cavidade, durante pelo menos algumas horas antes da cultura os neurónios. NOTA: Fluoro-desoxiuridina pára divisão astrócitos. Mudar a forma de 1,5 ml de bas neuronaismédio ai (ver a Tabela de Materiais) contendo 1% de L-alanil-L-glutamina (ver a Tabela de Materiais), 2% de suplemento sem soro para células neuronais (ver a tabela de materiais), e 0,2% de penicilina-estreptomicina . Preparar solução de papaína por adição de 20 unidades de papaína para 5 mL de solução de enzima (Cisteína 1,65 mM, CaCl 2 1 mM, e EDTA 0,5 mM em DMEM). Acidifica-se a solução por passagem de CO 2 gasoso durante 20 min. Filtro-esterilizar com um filtro de 0,22. Colheita do cérebro a partir de um P0 – 2 de rato 18. Imediatamente transferir o cérebro para gelada Hanks'-solução salina equilibrada (HBSS). Dissecar os hipocampos sob um microscópio estereoscópico, mantendo o tecido submerso em HBSS. Colocar os dois hipocampos em 1 ml da solução de papaína preparado no passo 1.11. Incubar durante 1 h num termomisturador a 37 ° C e 750 rpm. Substituir a papaína com 1 ml de solução contendo inactivação2,5 mg de inibidor de tripsina e 0,5 mg de albumina por mL de DMEM. Incubar durante 5 min a 37 ° C. Aspirar off a solução de inactivação. Adicionar 200? L de meio basal neuronal (ver a Tabela de Materiais) para o hipocampo isolado. Tritura-se utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL para dissociar as células. Esperar até as células sem dissociar assentar no fundo. remover cuidadosamente o meio com células a partir do topo. Repita o passo 1.15 3x. Piscina todas as células dissociadas em um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Contar o número de células utilizando um hemocitómetro. Neurónios em placas a uma densidade de 6,5 x 10 4 culas / po no topo da camada de astrócitos preparados em passos de 1,1 – 1,10. Infectar os neurónios com lentivírus expressando channelrodopsina pelo DIV 3 (3 d in vitro) 18. Executar flash e por congelação em 14 DIV, como descrito nas etapas 2.1 – 2.5, abaixo. 2. Flash umd-Freeze Preparação de fixador Dentro de uma câmara química, acrescentar as substâncias seguintes a um tubo cónico para preparar o fixador: 2,5 ml de glutaraldeído (10% estoque em acetona), 0,25 g de tetróxido de ósmio, 0,25 mL de água, e 22,25 mL de acetona anidra. NOTA: A concentração final de cada componente deve ser de 1% em acetona. O glutaraldeído é adicionado para preservar as estruturas de proteínas durante a congelação-substituição. CUIDADO: A toxicidade aguda de tetróxido de ósmio é alta. A exposição aos vapores poderia danificar a córnea do olho. Ele deve ser manuseados somente em uma capa química certificada. Aliquota de 1 ml de fixador para frascos criogénicos numerados (2 mL). Manter o fixador congeladas em azoto líquido até à sua utilização. NOTA: tetróxido de ósmio e glutaraldeído reagem de forma cruzada e precipitar; assim, uma vez misturado, aluota imediatamente, a tampa dos tubos, e submergir os criotubos em azoto líquido para congelar o fixador. Use um lápis para contar o criofrascos génicos, desde acetona pode lavar marcadores. Preparação de solução salina fisiológica Adicione solução salina fisiológica através da mistura de tampão Hepes (10 mM, pH 7,5), NaCl (140 mM), KCl (2,4 mM) e glucose (10 mM). NOTA: Estes valores são as concentrações finais. Crio-protetores não são utilizados para culturas em monocamada. No entanto, uma adequada crioprotector é necessária para os espécimes mais espessa do que 5? M. A utilização de 20% de BSA é normalmente recomendada. Pasta de levedura e OP50 E. coli também pode ser utilizado como material crio-protectores para larvas de moscas ou C. elegans. Adicionar CaCl2 a 4 mM e MgCl 2 em concentrações finais de 1 mM. NOTA: As concentrações de CaCl2 e MgCl2 variam de acordo com as experiências. Para assegurar a captura de intermediários exocíticos, cálcio 4 mM é usado para estas experiências particulares para aumentar a probabilidade de libertação de vesículas 18. Verifica aosmolaridade utilizando um osmómetro. Garantir que é 300 ± 5 mOsm. Adicionar antagonista do receptor AMPA (NBQX) para uma concentração final de 3 pM e antagonista do receptor de GABA (bicuculina) para uma concentração final de 30 uM. NOTA: os antagonistas dos receptores de neurotransmissor são adicionados para evitar actividade rede recorrente após estimulação neuronal 18. Aquecer-se a solução salina fisiológica a 37 ° C durante a utilização. Preparação da Specialized de alta pressão Freezer e uma Unidade Automated Congelar Substituição Antes da congelação de alta pressão, arrefecer uma unidade de substituição congelamento automatizado para -90 ° C, por enchimento do tanque com azoto líquido. Arrefecer acetona em um pequeno copo para -90 ° C, colocando-o no interior da câmara de espécimes. Encher o vaso Dewar de azoto líquido e Dewar armazenamento do congelador de alta pressão (ver a Tabela de Materiais) com nitro líquidagen. Configure o protocolo de estimulação de luz usando o monitor touch screen. Nome do programa, clicando em "Editar" ao lado de "Nome do programa" na janela estimulação luminosa. Outra janela pop-up. Defina-se um programa escrevendo "15.000 ms" em "fase escura", "100 ms" em "período", "10 ms" em "impulso", e "1", em "número de períodos" para um único estímulo de 10 Senhora. Congelar as células 90 ms mais tarde (Figura 1C). NOTA: A "fase escura" permite que as células para recuperar da exposição à luz durante o carregamento da amostra. "Período de" define a freqüência de estimulação. Por exemplo, se o estímulo deve ser aplicada a 20 Hz, esta coluna deverá ser fixado em 50 ms. "Pulse" define a duração do estímulo luminoso. Finalmente, o "número de períodos de" define o número total de estímulos. Para a criação de uma estimulação de alta frequência, consulte <strong> Figura 1E. Para um "sem estimulao" de controlo, tipo "15 s" em "fase escura," "0 ms" em "período", "de 1 ms" em "impulso" e "0", em "número de períodos de" na luz a janela de configuração estimulação, como descrito no passo 2.3.4. NOTA: Por padrão, o "pulso" deve ser de pelo menos 1 ms. Na tela principal, certifique-se de que a caixa de estimulação luminosa está marcada. Configure o protocolo de armazenamento, clicando em "Specimen armazenamento" na tela principal. Clique em "Editar". Na janela seguinte, utilizar "+" ou "-", para seleccionar "2" para armazenar discos 2 em cada canal (3 canais no total). Marque a opção "Armazenamento LN2 habilitado." Amostra Carregando e congelamento na de alta pressão Freezer Nota: Todos os montagem de amostra e carregamento passos são feitos sob estereomicroscópio com uma gama 7.5-60X ampliação. A tweezer é utilizado em passos 2.4.1 – 2.4.4 para manipular as amostras. Os ensaios devem ser realizados à temperatura fisiológica. Colocar um disco de safira, célula do lado virado para cima, no poço da placa preto, média (Figura 1B). Colocar um anel espaçador 100 um sobre o disco de safira (Figura 1B). Colocar um disco de safira branco sobre o anel de distanciamento (Figura 1B) após imersão de um lado do disco na solução salina pré-aquecida do passo 2.2. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar estão presos entre os dois discos de safira. Coloque um outro anel espaçador 100 e um anel espaçador 400 um (Figura 1B). Retirar o líquido extra usando papel de filtro. Colocar a montagem a partir do passo 2.4.3 entre os dois semi-cilindros transparentes (Figura 1A). Feche a tampa vermelha de cima para iniciar o processo de congelamento. NOTA: O protocolo preestabelecido é executado automaticamente uma vez que a tampa é fechada. A amostra permanece na mesma orientação na câmara de congelação, e um flash de luz é aplicado a partir do topo do conjunto da amostra. A capa vermelha aparece de volta-se automaticamente assim que o processo de congelamento é concluída. Armazenar a amostra no dewar armazenamento. NOTA: Após a congelação, o espécime é automaticamente cair dentro de um recipiente Dewar cheio de armazenagem com azoto líquido e armazenado ali até posterior processamento. O Dewar armazenamento tem três câmaras, e cada câmara pode conter até 3 amostras no máximo. Tipicamente, duas amostras são congeladas sob as mesmas condições de estimulação, e o congelador de alta pressão é programado para armazenar tanto na mesma câmara. Repita os passos 2.4.1 – 2.4.6 para cada espécime. Avance para o passo 2.5 uma vez que todas as câmaras estão cheias. NOTA: O dispositivo foi ajustado para armazenar até 6 espécimes no Dewar de armazenamento de cada vez. Por isso, depois de cada amostra 6 th, passo 2.5 deve ser realizada. Uma vez descarregado, repita os passos 2.4.1 – 2.4.6. Amostra recolha e transferência para uma Unidade de Freeze-substituição Automated Abrir a porta para o Dewar de armazenamento, que está localizado por baixo da mesa de congelador de alta pressão. Remova o dewar armazenamento e colocá-lo na bancada. Usando as mãos, remover a amostra da câmara a partir do recipiente Dewar e transferi-la no tabuleiro de amostras especializado cheio com azoto líquido. Desbloquear o botão para libertar a taça para espécimes. Remover os meios-cilindros transparentes do copo de amostra usando um par de pinças depois de pré-arrefecimento das pontas das pinças com azoto líquido (-196 ° C ~). Transferir cuidadosamente o meio, placa preta para um pequeno copo contendo azoto líquido. NOTA: As pontas das pinças tem de ser pré-arrefecido para a temperatura do azoto líquido. A amostra deve ser mantida em azoto líquido em todos os momentos para evitar a formação de cristais de gelo. 3. Congelar Substituição no Automated Freeze-substituição Unit Usando pinças previamente arrefecidas (dicas a ~ 196 ° C), transferir rapidamente o prato do meio a partir do passo 2.5.3 para a acetona pré-arrefecida (-90 ° C). Separar o disco de safira da placa média por agitando ou batendo. NOTA: Ocasionalmente, pode ser difícil separar o disco de safira da placa média. Em tal situação, deixar a placa em meio de acetona pré-arrefecida (-90 ° C) durante alguns minutos. toque suave com uma pinça também ajuda a dissociar a safira da placa média. Coloque um criotubo contendo fixadores (passo 2.1) no interior de uma câmara de espécimes da unidade de substituição. Transferir o disco de safira para o criotubo e coloca uma tampa sobre o frasco. Defina-se o programa de substituição de congelamento como se segue: (i) de -90 ° C durante 5-30 h, (ii) -90 – -20 ° C em 14 horas (5 ° C / h), (iii) temperatura de -20 ° C durante 12 h, e (iv) a -20 ° C – 20 ° C em 4 h (10 ° C / h). NOTA: O duração do primeiro passo a -90 ° C pode ser variada. A duração total de substituição por congelação é definida de tal modo que o programa termina na parte da manhã (1,5 ~ d postexperiment) em torno de 8:00 de modo que os passos subsequentes podem ser realizados durante o dia. 4. A infiltração e a incorporação de plástico com resina epóxi Uma vez que o programa termina, usar luvas para transferir os frascos criogénicos contendo os discos de safira da câmara de espécimes da unidade de substituição para um capuz química. Usando uma pipeta, adicionar acetona (temperatura ambiente) a cada frasco criogénico e lave cada disco safira 4 – 6x durante 1 – 2 h. Opcionalmente, incuba-se as amostras em 0,1% de acetato de uranilo durante 1 h, se o contraste adicional é necessária. Lavar 4 – 6x com acetona durante 1 – 2 h. NOTA: CUIDADO: Há risco associado à exposição interna na sequência da inalação de acetato de uranilo, que provoca a irritação do tracto respiratório superior. Alta exposição pode DAMAGcélulas do sangue e. Trabalhar com acetato de uranilo deve ser feito sob ventilação de escape. vestuário de protecção é recomendado. Prepare a forma de resina epoxi líquida por pesagem de 6,2 g de éter poliglicidílico de glicerol, 4,4 g de bisfenol-A resina epóxi, e 12,2 g de anidrido succínico de dodecenilo (DDSA). Misturar bem e adicionar 800 ul de benzil dimetilamina (BDMA), enquanto se mistura. De-gás, durante 10 min. Preparar 30, 70, e 90% de resina epoxi em acetona a partir da resina epoxi 100%, preparado no passo 4.4. Adicionar resina epóxi 30% para os frascos criogénicos contendo discos de safira e incubar durante 2 – 3 h à TA num agitador orbital a 120 rpm. Substituir a resina epóxi 30% com resina epóxi 70% por pipetagem e incubar durante 3 – 4 h, à TA num agitador orbital. Usando pinças, transferir cada disco de safira, de células-lateral para cima, para a tampa de uma cápsula de incorporação. Adicionar resina epóxi 90% para a tampa. Incubar O / N a 4 ° C. No dia seguinte, fazer meio fresco resina epoxi, tal como no passo 4.4. Transferir cada disco de safira, célula do lado virado para cima, para a tampa de uma cápsula de incorporação. Encher a tampa com resina epoxi 100% preparado de fresco. Mudar a resina fresca de epóxi de 100% a cada 2 horas, repetindo três vezes. Coloque as amostras num forno a 60 ° C durante 48 horas para polimerizar. 5. As amostras de montagem Colocar a amostra de cabeça para baixo sobre o estereomicroscópio de modo que o disco de safira está localizado na parte superior do bloco de resina. Retirar a camada fina de resina epoxi a partir do topo por raspagem com uma lâmina de barbear. Usando uma lâmina de barbear, uma linha de corte raso ao longo da borda do disco de safira; esta linha ajuda a separar o disco de safira a partir da resina epoxi no passo 5.3. Separa-se o disco de safira a partir da resina epoxi por imersão em azoto líquido durante aproximadamente 10 s. NOTA: As células vão ficar na resina epóxi. Depois de retirar o disco de safira, usar um escopo de dissecação para encontrar uma área com células (4-10x ampliação). Corte em torno da região de interesse (~ 2 x 2 mm), utilizando uma lâmina de barbear (de dois gumes). Para manter a amostra no lugar, realizar esta etapa, enquanto a amostra é colado na superfície do microscópio. Montar o pequeno pedaço de plástico (~ 2 x 2 x 5 mm) contendo as células utilizando cola de cianoacrilato contendo acetato num bloco manequim cilíndrica feita de resina epoxi. Incubar o bloco a 60 ° C durante 1 h. 6. Seccionamento Use um ultramicrótomo a seção da amostra. Aparar a superfície do espécime de plástico encaixado com uma faca de vidro a uma velocidade de 3 mm / s e uma espessura de 200 nm / secção. Corte 4 – 5 secções da superfície onde os astrócitos estão localizados. Mudar para um bisturi de diamante e secção a uma velocidade de 0,8 mm / s e uma espessura de 40 nm / s. Cortar 20 – 25 seções. Recolhe fitas de secções sobre grelhas de cobre com um único slot cobertas com 0,7% de acetato de polivinilo (vera Tabela de Materiais). 7. Imagem Usando um Microscópio Eletrônico de Transmissão (TEM) Antes de MET imagiologia, manchar a secção com 2,5% de acetato de uranilo em metanol durante 5 min. Lava-se a 15x grelha em 50% de metanol. Em seguida, lava-se em água ultrapura 15x, com cada lavagem com duração de 30 s. Resumidamente ar-secar a secção e colocar a grelha num suporte de espécime de TEM. Imagem em 93,000X ampliação. Adquirir imagens. NOTA: Imagiologia é tipicamente feito cego para os pontos de tempo ou genótipos, e tipicamente ~ 200 imagens são recolhidas / ponto de tempo. Análise 8. Imagem Analisar as imagens usando um software (por exemplo, ImageJ) com uma macro personalizada (Watanabe, Davis, e Jorgensen, não publicado). NOTA: O x / y coordenadas são registadas a partir de vesículas, a membrana do plasma, a membrana zona activa, e todos os outros organelos ligados à membrana nas sinapses. O fil textoes que contêm as informações são exportados para outro software (por exemplo, Matlab). Os dados são posteriormente analisados ​​usando programas personalizados.

Representative Results

Usando o protocolo acima descrito, foi realizada "flash" e por congelação experiências em neurónios do hipocampo de rato que expressam channelrodopsina. Estes neurónios foram congelados quer 15 ms ou de 100 ms após o aparecimento de luz. Foi anteriormente mostrado que a exocitose e endocitose de vesículas sinápticas ocorrem nos terminais sinápticos aos 15 ms e 100 ms de tempo pontos, respectivamente 18. Estes eventos foram capturados com sucesso nos momentos apropriados (Figura 2), sugerindo que as experiências de flash-e-congelamento pode ser realizado com sucesso no congelador de alta pressão especializado escolhido (ver a Tabela de Materiais). Figura 1. Amostra Carregando e Programação na de alta pressão Freezer. A) Amostra mesa de carga de um p de altacongelador ressure. A placa intermédia, representada na inserção para o detalhe estrutural, está colocada num suporte de CLEM para o carregamento da amostra. Um dos meios-cilindros é colocado na parte inferior da mesa de carga da amostra, e o outro está ligado com um grampo para a tampa superior. Uma vez que a amostra é carregada, a placa intermédia é empurrado para a frente para o meio-cilindro inferior e a tampa é fechada para iniciar o congelamento. B) O conjunto de amostras. O disco de safira contendo neurónios é colocada no poço do prato do meio, com o lado voltado para cima célula. Um anel 100 um é colocado directamente por cima do disco de safira dentro do poço. Em seguida, um disco de safira vazio mergulhada em solução salina fisiológica é colocado com o lado da solução a abaixo. As bolhas de ar deve ser evitada. Finalmente, um anel 100 e um anel 400 um são confortavelmente colocado acima. Qualquer líquido extra é removido com papel de filtro. C) uma secção transversal de uma cápsula de encaixar com o disco de safira submerso em resina epoxi. o sappcontratar disco é colocada na parte inferior da cápsula, com o lado voltado para cima célula e coberto com resina epoxi, para a infiltração e a incorporação. D) A programação do congelador de alta pressão para uma única, 10 ms estímulo. As amostras são congeladas 90 ms após o pulso de luz. E) A programação do congelador de alta pressão, durante 10 a 20 Hz estímulos. As amostras são congeladas 5 ms após o último pulso de luz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Visualização de exocitose e endocitose no rato neurônios do hipocampo. neurónios do hipocampo são estimulados uma vez e congeladas nos tempos indicados. Eletromicrografias mostrar a exocitose de uma vesícula sináptica A) e endocitose ultra-rápida <strong> B). PSD, densidade pós-sináptica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A abordagem de "flash-e-congelamento" visualiza a dinâmica da membrana através da indução de um evento celular particular com Optogenetics e por células em pontos de tempo definidos após estimulação congelação 19. Nesta demonstração, foi utilizado channelrodopsina, um canal de catiões sensível à luz, para estimular os neurónios e capturado a fusão e a recuperação das vesículas sinápticas nos terminais sinápticos. Nos últimos anos, muitas ferramentas optogenética foram desenvolvidos 22, 23, todos os quais são compatíveis com flash-e-congelamento. Por exemplo, o tráfico organelo pode ser induzida utilizando a heterodimerização induzida por luz do criptocromo e CIB1 24. Da mesma forma, a composição lipídica da membrana plasmática podem ser alteradas pela translocação induzida pela luz de fosfatases Phosphoinositide para a membrana plasmática 25. Além disso, pequenas, compostos sensíveis à luz, como ch azobenzenoange conformação dependendo dos comprimentos de onda de iluminao. Esta alteração conformacional pode ser usado para activar os canais dependentes de ligandos ou para alterar a composição de lípidos na membrana 26, 27. compostos enjaulados também pode ser utilizado para induzir a actividade celular. No entanto, o LED usado na configuração atual não pode produzir energia suficiente para uncaging; Assim, outras optimizações do sistema são provavelmente necessário. No entanto, as aplicações dessas ferramentas luz-activáveis ​​são eventos celulares flexíveis-muitos pode ser induzida por um flash de luz. "Flash-e-congelamento" pode capturar a dinâmica de membrana resultantes.

Existem duas principais limitações para o método "flash-e-congelamento". Primeiro, ele capta "instantâneos" de um evento em particular a partir de células diferentes. Em outras palavras, não é possível seguir a dinâmica da membrana de uma célula ao longo de um período de tempo. Assim, para a reconstrução de qualquer celular mesmot, deve-se adquirir e analisar um grande número de imagens de cada amostra e em cada ponto de tempo. Além disso, em neurónios, um número ainda maior de imagens é necessário, uma vez que a fusão de vesículas sinápticas leva apenas lugares em 20 – 30% das sinapses em neurónios do hipocampo do rato 18, 28. A análise de um grande conjunto de dados, tais requer enormes quantidades de tempo. No futuro, aquisição e análise de imagem precisa ser automatizado para fazer a abordagem mais eficiente 29, 30.

A segunda limitação é imposta pela natureza da técnica de congelamento de alta pressão. Quando as células congelação, a água celular rearranja para formar cristais de gelo se a velocidade de congelação é abaixo de 100 K / s 21. Estes cristais de gelo podem penetrar as membranas ou concentrar solutos para alterar a pressão osmótica local, resultando na ruptura das membranas. Para evitar cristais de gelo, high Pressão (~ 2,000 atm) é aplicado às amostras. Devido ao efeito de super-arrefecimento, uma velocidade de congelação de 100 K / s é suficiente para evitar que a água se formem cristais de gelo a esta pressão 21. Em teoria, as amostras tão espessa quanto a 500? M podem ser congelados sem cristais de gelo, mas cerca de 200 um é provavelmente o limite prático, como formas cubóides de gelo tenderem a formar no tecido grosso, comprometer a morfologia. Quando o processamento de amostras mais espessa do que 5? M, a utilização de um crio-protector adequado, tal como BSA, é necessária. No entanto, BSA irá alterar a osmolaridade da solução e pode afectar a resposta fisiológica de células. Portanto, extensas experiências de controlo são necessários para validar a utilização de BSA em sistemas particulares. Os cristais de gelo também podem formar após congelamento de alta pressão, se os espécimes serem acidentalmente removidas do banho de azoto líquido. Assim, é crítico para manter os espécimes em azoto líquido em todos os momentos e para utilizar uma pinça pré-arrefecida atémanipulá-los.

Ao planejar experimentos, os três seguintes pontos devem ser considerados. Em primeiro lugar, a intensidade máxima de luz (a linha de 460 nm) é 5,5-8,0 mW / mm 2. Se esta intensidade suficiente para induzir a actividade deve ser verificada com o processamento de imagem de células vivas em um microscópio de fluorescência antes das experiências de flash-e-congelante. Em segundo lugar, as experiências devem ser realizadas à temperatura fisiológica. A fase do congelador de alta pressão é aquecido até 37 ° C para as experiências com os neurónios do hipocampo do rato 31. Finalmente, os pontos de tempo devem ser cuidadosamente escolhidos para capturar a dinâmica de membrana. Estudos iniciais indicaram que a endocitose é completa após 100 ms de estimulação. Assim, três pontos de tempo adicionais (15, 30, e 50 ms) também foram examinados a seguir a dinâmica da membrana 17, 18. Estes pontos de tempo foram necessários para visualizar evento tráfico de membranas durante a transmissão sináptica. No entanto, a exigência para o número de pontos de tempo são diferentes em cada caso celular. Portanto, alguns pontos de tempo devem ser amostradas antes de iniciar coleção grande conjunto de dados.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Universidade Johns Hopkins (SW). Agradecemos ao Johns Hopkins School of Medicine Microscope Facility pelo apoio técnico. Agradecemos Erik Jorgensen e Christian Rosenmund e membros de seus laboratórios para o desenvolvimento da técnica. Agradecemos a M. Wayne Davis para o design do dispositivo inicial. Agradecemos a Paul Wurzinger, Cveta Tomova, e Delgermaa Luvsanjav por sua assistência técnica. Agradecemos também a Natalie R. Hamilton e Grant F. Kusick por sua leitura crítica do manuscrito.

Materials

Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System  for Light and Electron Microscopy -AFS II Leica 
High Pressure Freezer – EM-ICE Leica  EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.
Osmometer Gonotec
Ultramicrotome UC7 Leica 
Oven Blue M
Razor blade Personna
Glutaraldehyde EMS 16530
Osmium tetroxide EMS RT19132 Toxic, open only under certified chemical hood
Acetone EMS RT10016
HEPES Emdmillipore 391340-250GM
Glucose Sigma 49159-1KG
KCl Sigma 746436-1KG
NaCl Sigma S7653-1KG
CaCl2 Sigma 21115-250ML
MgCl2 J.T.Baker 2444-01
Liquid epoxy resin Eponate 12 Ted Pella 18028
Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 Ted Pella 18028
Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) Ted Pella 18028
Benzyl dimethyl amine (BDMA) Ted Pella 18241
Special embedding (BEEM) capsule EMS 70021
Copper Grid Ted Pella 1GC12H
Polyvinyl acetate (Pioloform F) Ted Pella 19244
Uranyl acetate Polysciences 21447-25
Ethyl cyanoacrylate (Super glue) Scotch 170497
Trypsin-EDTA Themo scientific 25300-120
DMEM Thermo scientific 10569-044 Should be warmed at 37°C before use
FBS Thermo scientific 26140-079
Pen-Strep Thermo scientific 15140-122
Fluoro-deoxyuridine (FUDR) Sigma F0503
Glass cover slip Fisher S175223 Should be acid-washed
Sapphire disc Technotrade 616-100
Acetic acid Emdmillipore 1000631011
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Rat tail collagen Thermo scientific A10483-01
Neurobasal A Fisher 10888022 Should be warmed at 37°C before use
L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) Fisher 35050-079
Seraum free supplement  (B-27)  Fisher 17504044
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific 24020117
Papain Worthington LS003126 Active Unit should be calculated for each batch
Thermomixer Eppendorf  Thermomixer C
Trypsin inhibitor Sigma T9253
NBQX Tocris 03-731-0
Bicculine Tocris 01-091-0
Whatman I filter paper GE
Transmission Electron Microscope Philips CM20
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参考文献

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Li, S., Raychaudhuri, S., Watanabe, S. Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e55664, doi:10.3791/55664 (2017).
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