Determinazione di alta affinità antigene-anticorpo cinetica del legame con quattro piattaforme biosensore
概要
Descriviamo qui Protocolli per la misurazione di anticorpo-antigene affinità e cinetica usando quattro piattaforme biosensore comunemente utilizzati vincolante.
Abstract
biosensori ottici privi di Label sono potenti strumenti nella scoperta di nuovi farmaci per la caratterizzazione delle interazioni biomolecolari. In questo studio, si descrive l'utilizzo di quattro piattaforme biosensore comunemente impiegati nel nostro laboratorio per valutare l'affinità di legame e cinetica di dieci anticorpi ad alta affinità monoclonali (mAb) contro proprotein umano convertasi subtilisina tipo KEXIN 9 (PCSK9). Mentre sia Biacore T100 e ProteOn XPR36 sono derivati dalla tecnologia (SPR) consolidata Plasmon superficie risonanza, il primo ha quattro celle di flusso collegati da configurazione flusso seriale, mentre il secondo presenta 36 punti di reazione in parallelo attraverso un improvvisato 6 x 6 incrociato configurazione del canale microfluidico. All'IBIS MX96 opera anche basato sulla tecnologia dei sensori SPR, con una funzione di imaging aggiuntivo che fornisce rilevamento orientamento spaziale. Questa tecnica di rilevazione accoppiato con il flusso continuo Microspotter (CFM) espande il throughput significativamente tramite enabling multiplex stampa array e il rilevamento di 96 sport di reazione contemporaneamente. Al contrario, l'Octet RED384 si basa sul principio ottico BioLayer interferometria (BLI), con sonde fibra ottica che agisce come biosensore per rilevare variazioni configurazione di interferenza dalle interazioni di legame alla superficie punta. A differenza delle piattaforme SPR-base, il sistema BLI non si basa su fluidica flusso continuo; invece, le punte del sensore raccogliere letture mentre sono immersi in soluzioni analita di 384 micropiastra durante l'agitazione orbitale.
Ognuna di queste piattaforme biosensore ha i suoi vantaggi e svantaggi. Per fornire un confronto diretto della capacità di questi strumenti per fornire dati cinetici di qualità, i protocolli descritti illustrano esperimenti che utilizzano lo stesso formato del test e gli stessi reagenti di alta qualità per caratterizzare la cinetica antigene-anticorpo che si adattano alla semplice 1: 1 modello di interazione molecolare .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro studio di confronto testa a testa mostra che ogni piattaforma biosensore ha i suoi punti di forza e di debolezza. Anche se i profili di legame degli anticorpi sono simili per confronto visivo (figure 3 – 6), e l'ordine di classificazione delle costanti di velocità cinetiche acquisiti sono altamente coerente tra gli strumenti (Figura 7), i nostri risultati dimostrano che gli strumenti SPR-based con continui fluidica flusso) sono meglio a risolvere le interazioni ad alta affinità con tassi di dissociazione lenti. Deriva verso l'alto durante la fase di dissociazione si osserva in set di dati (ad esempio, mAb 2, mAb 5, e mAb 9; figura 5) generato dal fluidica libere strumento BLI. Questo risultato può essere attribuito in gran parte per evaporazione campione nel tempo nella micropiastra, che è una limitazione principale del sistema. Con questa limitazione intrinseca, il tempo sperimentale è anche limitato a meno di 12 h; gli esperimenti sono stati quindi programmati con shvolte Orter (500 s associazione e 30 min dissociazione) rispetto a quelle delle altre piattaforme (10 min associazione e 45 min dissociazione). Tuttavia, accorciando il tempo sperimentale non sembra attenuare l'impatto di evaporazione sulla qualità dei dati / coerenza, come le costanti di velocità generate dallo strumento BLI basata show less linearità a causa delle fluttuazioni in alcune delle off-rate (Figura 8C ). Oltre a evaporazione del campione, le differenze di reagenti di cattura utilizzati possono hanno anche contribuito alle differenze nei risultati ottenuti. Mentre la proteina A / G è stato utilizzato in tutte e tre le piattaforme SPR fluidici basata, sensori AHC sono stati utilizzati nella piattaforma BLI non fluidica. Poiché proteina A / G può avere una debole affinità per i mAbs che fa l'AHC, una superficie biosensore a base di anticorpi, l'off-rate del complesso mAb-antigene da / superfici proteina A G può artificialmente apparire più veloci di quelli ottenuto dalla superficie AHC. Questa possibilità è supportata by i dati sperimentali che dimostrano che i valori off-rate generati dalla piattaforma BLI erano notevolmente inferiori a quelli ottenuti dagli altri strumenti (Figura 7, linea rossa). Tuttavia, la piattaforma di BLI ha diversi vantaggi rispetto alle altre piattaforme. Ad esempio, è altamente flessibile per quanto riguarda la scelta del sensore e configurazione test dovuti ai diversi sensori pre-rivestite per uso immediato. Nei nostri esperimenti, l'uso dei sensori AHC eliminato la necessità di passaggi ligando immobilizzazione, riducendo i tempi di preparazione. Inoltre, la piattaforma BLI richiede molto meno manutenzione rispetto alle altre piattaforme fluidica SPR, che dispongono di configurazioni di tubi e l'interruttore valore complicati. Questa caratteristica è un vantaggio per gli esperimenti che coinvolgono campioni grezzi che possono causare problemi di intasamento e di contaminazione.
Poiché la domanda per l'identificazione efficiente, rapida e accurata dei candidati aumenta terapeutici, la necessità di biil throughput osensor è anche in aumento. Tra i quattro piattaforme biosensore, il throughput dal biosensore capace di 96-ligando stampa matrice è la più alta, seguita dal biosensore accoppiato ad un crisscrossing formato 36-ligando e il biosensore BLI-based con lettura simultanea 16 canali, che alla fine aumenta il numero di interazioni misurati in un singolo ciclo di legatura a 96, 36 e 16, rispettivamente. Queste capacità di throughput sono significativamente superiori a quella della piattaforma tradizionale SPR, che è limitata da avere solo quattro celle di flusso collegati da un unico flusso seriale. Dal momento che i nostri esperimenti coinvolti un insieme relativamente piccolo campione di 10 anticorpi monoclonali valutati a più densità di superficie con tempi di dissociazione lunghi, i throughput strumentali hanno giocato un ruolo moderato nel determinare l'efficienza degli esperimenti. Non ci sono state differenze significative nei tempi sperimentali delle tre piattaforme high-throughput, e in tutti i casi gli esperimenti sono stati completati in un giorno. D'altra parte, i tradizionali esperimenti SPR flusso seriale necessari 3 giorni per completare, nonostante l'automazione walk-away di acquisizione dei dati dopo l'installazione. In altri studi che coinvolgono un gran numero di campioni (cioè nell'ordine delle centinaia o migliaia), per scopi di classifica off-rate / di screening cinetica o epitopo di categorizzazione, il throughput diventa un fattore critico.
Sebbene il throughput in IBIS MX96 è ordini di grandezza superiore a quella degli altri biosensori ed è quindi una scelta ottimale per questi scopi, ha alcuni inconvenienti. In particolare, la stampa di matrice dal CFM mostra grandi incongruenze superficiali (Figura 1) e ridotta riproducibilità dati (Figura 8D e 8E). Per misurazioni cinetiche accurate, la quantità di legante sulla superficie biosensore è un parametro critico che deve essere controllato per garantire che le risposte vincolanti non sono disturbati da fattori secondari cometrasferimento di massa o impedimento sterico. Per il Biacore T100 e ProteOn XPR36, i livelli ottimali L R sono stati determinati sulla base del calcolo standard dei valori massimi serie R come descritto nell'articolo di ricerca 17. D'altra parte, per le piattaforme Octet RED384 e IBIS MX96, i livelli di cattura mAb stati raggiunti empiricamente usando una serie di anticorpi 2 volte diluiti serialmente in tempi costanti. La mancanza di conoscenza o il controllo della fase di cattura comportato una superficie ad alta densità e segnali ad alta vincolanti di risposta (Figura 2) che possono aver compromesso l'accuratezza delle costanti cinetiche. Inoltre, la separazione della stampante dal rivelatore SPR presenta anche una sfida per lo svolgimento di misurazioni multiple ciclo di legame che coinvolgano rigenerazioni. L'unico modo per eseguire la configurazione cinetica cicli multipli era attraverso accoppiamento di ammina diretta dei mAbs, al contrario di catturare attraverso il mAb Fc dalla immobilizzato proteina A / Gsuperficie negli altri tre piattaforme biosensori. Come risultato, un esperimento di rigenerazione esplorazione è stato necessario per determinare le condizioni di rigenerazione ottimali. Il risultato di questa configurazione è stato collegato a un ~ 90% inferiore attività superficiale osservata rispetto al metodo di cattura Fc (Figura 9), in aggiunta a un tempo più lungo sperimentale. Per eseguire il metodo di cattura Fc, è stato adottato un approccio cinetico-singolo ciclo alternativo. Questo approccio comporta l'iniezione sequenziale di analiti a concentrazioni crescenti senza rigenerazione fra ogni iniezione (Figura 2). Questo approccio altamente conveniente, ma meno comunemente applicato non solo ridotto il tempo sperimentale e ridotto consumo di reagenti, ma anche prodotto costanti di velocità cinetiche molto simili a quelle degli altri biosensori (Figura 7). Pertanto, l'applicazione di questo approccio cinetica ciclo unico supera la limitazione intrinseca configurazione dello strumento e presenta unapossibilità di ottenere ad alta risoluzione costanti di velocità cinetiche in maniera high-throughput.
Nonostante il throughput essere un grosso limite nel Biacore T100, i nostri risultati dimostrano collettivamente che ha generato i dati più coerenti con la massima qualità. Questo è stato seguito dal ProteOn XPR36, che ha ~ 10 volte maggiore produttività. La loro capacità di generare dati di alta qualità diventa un vantaggio quando caratterizzazione alta affinità interazioni anticorpo-antigene che può essere tecnicamente difficile al raggiungimento dei limiti di rilevabilità degli strumenti. Mentre le limitazioni sistematiche nella strumentazione dell'ottetto RED384 ostacolano la misurazione accurata di costanti di velocità di dissociazione (cioè, diminuzione oltre la sensibilità per risolvere decadimento del segnale sufficiente per lenta off-tassi), sia il Biacore T100 e ProteOn XPR36 può fornire sensibile ed affidabile rilevamento per la differenziazione.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Noah Ditto e Adam Miles per l'assistenza tecnica sul IBIS MX96.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
参考文献
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