Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

1. Proteine ​​und Antikörper Produzieren und reinigen , den menschlichen Proproteinkonvertase Subtilisin Kexin Typ 9 (PCSK9) und zehn Mäuse stammende anti-PCSK9 mAbs , wie zuvor beschrieben 17. Beurteilung der Reinheit der gereinigten Produkte durch sequentielles 10 & mgr; g jeder Probe in ein analytisches Größenausschlußchromatographie (SEC) -Säule Injizieren eines UPLC System 19. 2. Kinetische Messungen im Biacore T100 Instrument und Vorbereitung der Reagenzien Equilibrieren des CM5-Sensorchip für 15 min bei Raumtemperatur. Auftauen zwei 200 ul Aliquots von 200 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) und zwei 200 ul Aliquots von 50 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) bei Raumtemperatur. Bereiten einer 1-L Flasche 1x HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA und 0,005% v / v Polysorbat P20) Laufpuffer durch diLuting eine 10x HBS-EP + Stammlösung in Wasser. Herstellung von 1 ml Protein A / G bei 30 & mgr; g / ml in 10 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 500 ul jeder Probe bei mAb 0,063 ug / ml in HBS-EP-Laufpuffer. Tauen Sie ein gefrorenen Fläschchen menschlicher PCSK9 auf Eis. In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Extras | Eject Chip“, stellen Sie den Sensor-Chip in den Mantel und in der Nähe. Klicken Sie auf "Extras | Set Temperature", geben Sie "25" ° C wie die Analyse Temperatur und "10" ° C als die Raumtemperatur. Oberflächenimmobilisierung In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Datei | Öffnen / New Wizard Vorlage“ und wählen Sie „Immobilisation“ aus der Liste im linken Bereich. Klicken Sie auf „Neu“, um die Immobilisierung Setup-Fenster aufzurufen. Wähle „CM5“, wie der Chip-Typ und wählt „1“ Durchflußzelle pro Zyklus. Markieren Sie das Kästchen neben jede „Immobilisieren Flusszelle 1/2/3/4“ zu activate die Optionen. Wählen „für immobilisierte Ziel-Ebene“ und „Amin“, wie das Verfahren für alle Durchflusszellen. Geben Sie „30 ug / mL ProA / G“ als Ligand, sicherzustellen, dass der Zielwert wird auf „10000“ Response Units (RU) für alle von den Durchflusszellen. Check "Prime vor run", und klicken Sie auf "Weiter". Wählen „Reagenzhalter 2“ ist, definiert die Position für die Reagenzien und die Pipette in einzelne Probenfläschchen entsprechend. Legen Sie das Rack zurück in das Gerät, und klicken Sie auf „Start“ und geben Sie ein Experiment Namen gespeichert werden, um den Lauf zu starten. Analytbindemittels und Regenerationszyklen Klicken Sie auf „Datei | Öffnen / Neue Methode“, wählen Sie „20140812 hu anti-PCSK9 IgGs Bindung an hu PCSK9“ und die Methode öffnen. Überprüfen Sie die Parameter in der Methode. In "Assay-Schritten", sicherzustellen, dass es 10 Zyklen, in denen "hu PCSK9" ist der Name mit "Sample" ausgewählt in „PurpOSE 1 ‚“. Die Wiederholungszahl wird eingestellt‘. In "Cycle Types", die Kontaktzeit auf "220" s für Capture 1 über Strömungspfad "2", "110" s für Capture 2 über Strömungspfad "3" und "55" s für Capture 3 über Strömungspfad eingestellt "4". Die Strömungsrate „10“ & mgr; l / min für alle der Erfassungszyklen. Wählen Sie „Probe 1“, überprüfen Sie „Musterlösung“ als Variable. Stellen Sie die Kontaktzeit auf „600“ s und die Dissoziation Zeit auf „2700“ s über Strömungspfad „1, 2, 3, 4“. Die Strömungsgeschwindigkeit wird auf „30“ & mgr; l / min eingestellt. Wählen "Regeneration 1" ist, geben "Glycin-HCl pH 1,5" in der Lösung Feld die Kontaktzeit auf "20" s über Strömungspfad "1, 2, 3, 4". In "Variable Settings" Geben 2fache Konzentrationen von "100 nM – 6,25 nM" Titrieren für Zyklus 1-3 "50 nM – 3,12 nM" für Zyklus 4-8, und "5 nM – 0,323 nM" foder Zyklus 9-10. In "Setup Run", wählen Sie den Detektionsströmungspfad "2-1, 3-1, 4-1", klicken Sie auf "Weiter", überprüfen Sie "Prime vor run", und klicken Sie auf "Weiter". Wählen „Sample and Reagenzhalter 1“ ist, definieren die Position für die Reagenzien und die Pipette in einzelne Probenfläschchen entsprechend. Legen Sie die Zahnstange in das Gerät, und klicken Sie auf „Start“ und geben Sie ein Experiment Namen gespeichert werden, um den Lauf zu starten. Datenanalyse mit BIAevaluation Klicken Sie auf „Kinetics / Affinity | Oberfläche gebunden“, wählen Fc „2-1“, „3-1“ oder „4-1“ getrennt und überprüfen sowie die „Null“ alle angezeigten Kurven aus den verschiedenen Analytkonzentrationen Konzentration leer. Klicken Sie auf „Weiter“, um den Puffer leer abgezogen Kurven zu erhalten. Klicken Sie dann auf „Kinetics“, wählen Sie die „1: 1 Bindung“ -Modell, und klicken Sie auf „Anpassen“ die angepasste kinetische parame zu erhaltenters. Für den globalen Einbau mehrerer mAb Oberflächen, klicken Sie auf „Multiple R max“ an der Unterseite und die Bindungskurven von dem anderen Fcs für den gleichen mAb zur Liste hinzuzufügen. Klicken Sie auf „Weiter“, um alle Puffer leer abgezogen Bindungskurven zu erhalten. Klicken Sie dann auf „Kinetics“ , wählen Sie „1: 1 Bindung“ -Modell, und wählen Sie „local fit“ für jeden R max in den Parametern , die global ausgestattet kinetischen Parameter zu erhalten. 3. Kinetische Messungen im PROTEON XPR36 Instrument und Vorbereitung der Reagenzien Equilibrieren einen GLM-Sensorchip und eine 2-L Flasche PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% Tween-20 und 3 mM EDTA) Laufpuffer für 15 min bei Raumtemperatur. In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Auswerfen“ und dann den GLM-Chip einsetzen. Stellen Sie die Chiptemperatur auf „25“ ° C und die Autosampler Temperatur auf „10“ ° C.Klicken Sie auf „Glycerol Initialisierung“ und folgen Sie den Anweisungen aufgefordert, den Chip zu initialisieren. Klicken Sie auf „Datei | Öffnen“ eine Präkonditionierung Protokoll aus der Liste, werden die Lösungen in einer 96-Well-Platte. Klicken Sie dann auf „Ausführen“, wählen Sie das Protokoll und klicken Sie auf „Start“. Auftauen eine 1 ml-Aliquot von 400 mM EDC und eine 1 ml-Aliquot von 100 mM N-Hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) bei Raumtemperatur. Bereiten 2 ml-Protein A / G bei 60 & mgr; g / ml in 10 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 500 ul jede mAb Probe bei 0,25 & mgr; g / ml, 0,125 & mgr; g / ml und 0,063 & mgr; g / ml in PBS-T -EDTA Laufpuffer. Tauen Sie ein gefrorenen Fläschchen menschlicher PCSK9 auf Eis. Immobilisation, Analytbindemittels und Regeneration Klicken Sie auf „Datei | Neu | Neues Protokoll“. In „Konfiguration“, geben Sie die Testnamen, wählen Sie „GLM“ Chip, wählen Sie „Micro“ und „2.2“ ml Volumen ein. Wählen"Protocols | Samples" definieren "EDC / Sulfo-NHS" als "Aktivator" in Vertiefungen H1-H6, "Protein A / G" als "Ligand" in G1-G6 "Ethanolamine" als "Deaktivator" in F1-F6 "Glycine" als "Regenerator" in E1-E6, PBS-T-EDTA "als "freien Raum" in D1-D6 "mAb X Probe", wie "Ligand" in C1-C6, und "human PCSK9" als" Analyte in Vertiefungen H1-H6 in einer zweiten Platte mit 96 Vertiefungen. Wählen „Steps“, Doppelklick „Immobilisierung“ im „Protocol Editor“, wobei die Schritte umfassen drei aufeinanderfolgende horizontale Injektionen von EDC / Sulfo-NHS, Protein A / G, und 1 M Äthanolamin jeweils bei einer Flussrate von „30“ ul / min und eine Kontaktzeit von „300“ s. Auf „Regenerieren“, injiziert drei „18“ es Impulse von Glycin (pH 1,5) auf „100“ & mgr; l / min in horizontaler und vertikalen Richtung, gefolgt von zwei „60“ es Pulse von PBS-T-EDTA bei "25" & mgr; l / minauch in beiden Richtungen. Klicken „Ligand“, injiziert mAb 1 mAb 2 in der vertikalen Richtung, die eine Durchflussrate von „25“ & mgr; l / min und eine Kontaktzeit von „160“ s verwendet wird. Klicken „Analyt“, injizieren fünf Konzentrationen von humanem PCSK9 (100 nM auf 6,25 nM in 2-fache serielle Verdünnungen) und einen leeren Puffer über 6 horizontale Kanäle gleichzeitig, „40“ & mgr; l / min für „600“ s Vereinigungszeit verfolgt durch „2700“ s der Dissoziation Zeit. Auf „Regenerieren“, injizieren zwei „18“ -s Impulse von Glycin (pH 1,5) auf „100“ & mgr; l / min in horizontaler und vertikaler Richtung. Wiederholen Sie die Schritte nach jedem Bindungszyklus für die verbleibenden mAbs. HINWEIS: Zusätzlich zu der 100 nM – 6,25 nM menschlicher PCSK9 Konzentrationsreihe, 25 nM – 1,56 nM und 5 nM – 0,313 nM Konzentration Serie verwendet werden. Bereiten Sie die Proben und Reagenzien in zwei 96-Well-Platten nach den Reagenzpositionendefiniert in Schritt 3.2.2, dann auf die „Run“, wählen Sie das Protokoll / Experiment und klicken Sie auf „Start“. Mit Datenanalyse Proteon – Manager Klicken Sie auf „Bildschirmtyp“ und wählen Sie „Analyte“. Klicken Sie dann auf „Protokoll Step“ und alle Bindungskurven in der Liste auswählen. Klicken Sie auf "Auto-Verfahren", und klicken Sie auf "Process | Kanal Referenz | Interspot". Klicken Sie dann auf "Process | Doppel Referenz | Zeile | A6". für jeden mAb an allen drei Flächen für kinetische Analyse Klicken Sie auf „Datensatz erstellen“, um einzelne Datensätze zu speichern. Klicken Sie auf "Analysis Dataset", markieren jedes mAb-Datensatz und klicken Sie auf "Analyse | Kinetic". Wählen Sie „Langmuir“ -Modell und „Simultaneous ka / kd“ und klicken Sie auf „Weiter“. Markieren Sie sowohl die Assoziation und Dissoziation Anpassungsbereich, wählen Sie „Local“ R max, und klicken Sie auf „Weiter“ , um die Passform ausführen zu erhaltendie angepassten kinetischen Parameter. Wiederholen des obigen Schrittes , aber wählen „gruppierte“ R max für die Montage der experimentellen R max – Werte zu erhalten , für den Liganden Oberflächenaktivität zu berechnen. 4. Kinetische Messungen im Octet RED384 Reagenz und Probenplatte Vorbereitung Bereiten 50 ml 1x KB (Kinetic Buffer enthält PBS pH [7,4], 0,02% Tween-20, 0,1% Albumin und 0,05% Natriumazid) durch eine 10x Stammlösung in PBS verdünnt. Dispense das 1x KB in eine 96-Well-Platte mit 200 & mgr; l pro Vertiefung. Hydrat 48 anti-human capture (AHC) Biosensor Spitzen in diesen einzelnen Vertiefungen für mindestens 10 min. Bereiten Sie jede mAb Probe bei 20 ug / ml, 10 ug / ml und 5 ug / ml in 1 × KB, sowie menschliche PCSK9 bei 7 titriert Konzentrationen im Bereich von 100 nM bis 1,56 nM in 2-fache serielle Verdünnungen. Laden Sie die mAb Proben in ein 384-Well gekippt Boden Mikrotiterplatten (refeRred als das Reagenz Plate) und die menschliche PCSK9-Lösungen in einer anderen 384-well Mikrotiterplatten (bezeichnet als die Probenplatte) bei 90 & mgr; l pro Vertiefung. Last Reihe von 1x KB und Glycin (pH 1,5) Lösungen in den Vertiefungen in der Probenplatte. ANMERKUNG: Diese 1x KB Vertiefungen werden für die Chip-Vorkonditionierung Basislinienstabilisierung und Dissoziation Analyten verwendet. Die Glycin-Lösung wird zur Regenerierung verwendet. Experimentelles Verfahren einrichten In der Datenerfassungssoftware, klicken Sie auf "Experiment | New Experiment Wizard | New Kinetics Experiment | Kinetische". In „Platte Definition“, gehen Sie folgendermaßen vor den Probentypen und Positionen zu definieren. Wählen Sie „16“ Kanäle und „384er“ -Format. Definiert die Proben- und Reagenzien Orte in der Platte Anzeige durch gleichzeitiges Drücken der Umschalttaste gedrückt, während der linke Maustaste auf den Brunnen 16 Vertiefungen zu einer Zeit, zu markieren. Rechtsklick auf dieVertiefungen der mAb Proben enthalten, und „Load“ wählen, bei der den Schritt, um anzuzeigen, die mAbs auf die AHC-Sensoren (oder erfaßt) geladen. Geben Sie die mAb Namen und Konzentrationen in der Tabelle auf der rechten Seite. Rechtsklick auf die Vertiefungen, die die menschliche PCSK9 enthält und wählen „Sample“ den Schritt, um anzuzeigen, an denen die mAb-Sensoren erfasst werden, eingetaucht und die Bindungswechselwirkungen werden gemessen. Geben Sie die entsprechenden molaren Konzentrationen in der Tabelle auf der rechten Seite. Definiert die Vertiefungen mit 1x KB als „Puffer“ oder „Neutralisation“, und die Vertiefungen, die Glycin als „Regeneration“. In „Assay Definition“, gehen Sie folgendermaßen vor dem Versuchsaufbau zu definieren: Klicken Sie auf „Hinzufügen“ und wählen Sie „Baseline“, „Regeneration“, „Äquilibrierung“, „Laden“, „Vereinigung“ und „Dissoziation“ Schritte in die Liste mit den Zeiten von „30“ s, „30" , "18" s, "200" s, "500" s und "1800" s dar. Die shake Geschwindigkeit "1000" Umdrehungen pro Minute. Um die Schritte zu „Assay-Schritte-Liste“, klicken Sie zunächst auf einen Schritt hinzuzufügen, klicken Sie dann auf den lokalisierten Vertiefungen entweder in der Probe oder dem Reagenz Platte. Die Schritte sind wie folgt: Äquilibrierung-Regeneration: Voraussetzung der AHC-Sensoren um drei Zyklen von "15" es Dips in Glycin (pH 1,5), mit "15" alternierenden es Dips in 1x KB. Laden: fangen die mAb Proben auf die AHC-Sensoren für „200“ s. Baseline: stellt das BLI-Signal für „60“ s vor dem Assoziationsschritt. Verband: dip die Sensoren in den Vertiefungen variierender Konzentrationen von humanem PCSK9 für eine „500“ sich Assoziationszeit enthalten. Dissociation: dip PCSK9 gebundenen Sensoren in neue Vertiefungen 1x KB für eine „1,800“ es Dissoziation Periode. Regeneration: tauchen die mAb-PCSK9 bound Sensoren in Vertiefungen von Glycin (pH 1,5) mit zwei „18“ es Impulsen zwischen jedem Bindungszyklus. In „Bewertungs Experiment“, schieben Sie durch die Schritte und die erforderlichen Änderungen vor, indem sie zu den vorherigen Registerkarten zurück. In „Run Experiment“, geben Sie eine „60“ s Verzögerungszeit und schütteln Sie die Probenplatte während des Wartens. Stellen Sie die Plattentemperatur auf „25“ ° C und drücken Sie auf „GO“. Datenanalyse mit ForteBio der Datenanalyse – Software Klicken Sie auf „Datenauswahl | geladene Daten | Kinetics | PCSK9-Antikörper-Bindung an PCSK9 7.23.14“ In „Processing“, verarbeiten die Daten wie folgt: In Schritt 1: Klicken Sie auf „Sensorauswahl“ Sensoren in H1-H6 zu markieren, klicken Sie rechts auf sie und klicken Sie auf „Typ-Änderungs-Sensor | Referenzsensor.“ In Schritt 2 überprüfen „Subtraktion“ und wählen Sie „Average Reference Sensor“; jeden aktive Probe Sensor von dem Mittelwert der 6 leeren Puffersensoren zu subtrahieren. In Schritt 3 auf „Align Y-Achse“ und wählt „Baseline“ alle Bindungskurven zum Basisschritt vor der Vereinigung auszurichten. In Schritt 5 auf „Sawitzki-Golay-Filter“, um die Bindungskurven zu glätten, indem das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, und klicken Sie auf „Process Data“. In Schritt 6 Klicken Sie auf „Processed Ergebnisse“ die verarbeiteten Bindungskurven anzuzeigen. In Schritt 7 die vier Platten auf der rechten Seite überprüfen Sie die Bindungskurven nach jedem Verarbeitungsschritt angezeigt wird, und klicken Sie auf „Speichern von Daten verarbeitet“. In „Analyse“, überprüfen Sie „Assoziation und Dissoziation“ und wählen Sie „1: 1“ -Modell. Markieren Sie die Bindungskurven für „Global (voll)“ Fit und gruppieren sie durch „Farbe“. Verwendung „R max gebunden“ auszuführen , um die Gruppe mit dem gleichen m auf Sensoren Einpassen beschichtetAb – Konzentration die experimentellen R max – Werte für die Berechnung der Ligand Oberflächenaktivität und „R max von nicht verknüpft Sensor“ auszuführen globales Aufstecken auf Sensoren beschichtet mit mehreren mAb – Konzentrationen zu erhalten. Klicken Sie auf „Fit Curves“, um den Einbau Kinetik Parameter zu erhalten. Speichern Sie die Ergebnisse am Ende eines jeden Anpassungsanalyse. 5. Kinetische Messungen im IBIS MX96 Instrument und Vorbereitung der Reagenzien Äquilibrieren einen COOH-G-Chip für 15 min bei Raumtemperatur. Bereiten einer 1-l-Flasche von Systemlaufpuffer (PBS [pH 7,4], 0,01% Tween-20) und der Immobilisierung-Puffer (10 mM Natriumacetat [pH 5,0], 0,01% Tween-20). Bereiten jeden mAb von 20 ug / ml bis 0,16 ug / ml durch 2fache Reihenverdünnungen in sowohl dem Systemlaufpuffer und Natriumacetatpuffer (pH 5,0) Immobilisierungspuffer. Dispense die mAb Proben in zwei Septemberarate 96-Well-Platten, in der jeder mAb 8 vertikale Bohrungen bei den Titration Konzentrationen pro Vertiefung in 200 & mgr; L einnimmt. Auftau-Aliquots von 400 mM EDC und 100 mM sulfo-NHS bei Raumtemperatur. Bereiten 300 ul Protein-A / G bei 50 ug / ml in dem Natriumacetatpuffer (pH 5,0) Puffer und Immobilisierung Pipette in ein Glasfläschchen. Bereiten Sie 200 ul menschlichen PCSK9 von 100 nM bis 0,39 nM von 2-fach-Reihenverdünnungen im System-Laufpuffer. Pipettieren sie in separaten Fläschchen. Multi-cycle kinetics mit Amin-gekoppelten Antikörper – Arrays Mischen Sie die EDC / Sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) und Aliquots verzichtet das Gemisch in den oberen 48 Vertiefungen einer neuen Platte mit 96 Vertiefungen bei 200 & mgr; l pro Vertiefung. Platzieren Sie die mAb Quellenplatte (verdünnt in Natriumacetat [pH 5,0]) in Position 2 und die EDC / Sulfo-NHS-Reagens Platte in Position 1 in dem Drucker. Installieren des Sensorchips in das CFM. Öffnen Sie die "CFM 2.0" software, dann klicken Sie auf "Einstellungen laden | 96 Amine Paar". Die 10 x 8-Array-Antikörper wird wie folgt erstellt: Liefert die EDC / Sulfo-NHS in der oberen Hälfte der Reagenzplatte auf den Sensor 48 unter Verwendung von Mikrokanälen, und dem Zyklus sie über die Sensorfläche für „5“ min. Liefert die mAb Proben in der oberen Hälfte der Quellenplatte mit dem Sensor und Zyklus sie über die aktivierten Oberflächen für „10“ min. die Immobilisierung Puffer aus einer 50 ml konischen Röhre über die Antikörperoberfläche für „5“ min liefern. Wiederholen die vorstehenden Verfahren für die verbleibenden Proben mAb in der unteren Hälfte der Quellenplatte. Andocken des Drucksensorchips in das Instrument. In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Datei | Connect | Öffnen Mess | Bestehende Measurement“ und wählen Sie „2014.08.15“. In "Allgemein", wählen Sie "G – System Prime" unter "Full-System-Skript". Wählen Sie dann „G – QuEnch“, um die Oberflächen mAb zu deaktivieren, indem 150 & mgr; l 1 M Äthanolamin einzuspritzen. Klicken Sie auf „Kamera“, um den mAb-Arrays zu visualisieren und bei Bedarf den Kontrast einzustellen. Positionieren Sie die roten Kästchen die mAb-Spots zu umgeben, und bewegen Sie die grünen Kästchen zu den interspots zwischen den aktiven mAb-Spots befindet sich zur Referenzierung. In "Analyse-Zyklus", wählen Sie "A – AP Standard-Run" unter "IBIS Scripts". Set 1.0 min für die Baseline, 10,0 min für Verbindung und 90 Stufen für die Dissoziation bei 8 & mgr; l / s Geschwindigkeit. Innerhalb der „Zyklen“, injizieren menschliche PCSK9 eine Konzentration zu einem Zeitpunkt folgenden fünf Puffer Injektionen. Regeneriert die mAb Oberflächen mit Glycin pH 2,0 zwischen jedem Bindezyklus. Single-cycle kinetics mit Fc-Antikörper – Arrays eingefangen Installieren eines neuen Sensorchip in die CFM. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.3 5.2.5 oben durch die mAb-Proben mit Protein-A / G ersetzt wird. Entferne dasSensorchip von der MX96 und es zurück in den CFM Drucker einsetzen. Liefert die mAbs in der oberen Hälfte der Platte an die Protein A / G Sensoroberfläche 48 unter Verwendung von Mikrokanälen, und dem Zyklus sie über die Oberfläche für 10 min unter Verwendung von bidirektionalen Strömung. Wiederholen des obigen Schrittes für die verbleibenden Proben mAb in der unteren Hälfte der Platte. Andocken des Drucksensorchips in das MX96 Instrument. In der Datenerfassungs-Software, klicken Sie auf "Datei | Connect | Öffnen Mess | Bestehende Mess | Weiter" und wählen Sie "Protein A + G Bindung kinetic7.30.14". Klicken Sie auf „Kamera“, um den mAb-Arrays zu visualisieren und bei Bedarf den Kontrast einzustellen. Positionieren Sie die roten Kästchen die mAb-Spots zu umgeben, und bewegen Sie die grünen Kästchen zu den interspots zwischen den aktiven mAb-Spots befindet sich zur Referenzierung. In "Analyse-Zyklus", wählen Sie "A – AP Standard-Run" unter "IBIS Scripts". Set „1,0 min“ für die Baseline „, 10,0min“für Association, und‚10‘Schritte zur Dissoziation bei‚8 & mgr; l / sec‘Geschwindigkeit. Innerhalb der „Zyklen“, injizieren menschliche PCSK9 eine Konzentration zu einem Zeitpunkt folgenden fünf Puffer Injektionen. Keine Regeneration zwischen jeder Analyten Injektion durchgeführt. Datenanalyse mit Sprint- und Scrubber Im SprintX Sofware, klicken Sie auf „Datei | Öffnen Dreieck-Datei“, wählen Sie alle Probeninjektionen in der Liste, und klicken Sie auf „Speichern SprintX Datei“, „Kalibrierung“ und „RLL Bestimmung“, bevor Sie auf „Analyze“. HINWEIS: Die RLL-Werte beziehen sich auf die immobilisierte / erfasst mAb Niveaus auf der Sensoroberfläche. Check „Referenzierung“ und wählen Sie „Local“, die die benachbarten Referenzspots zu verwenden. Prüfen Sie auch, „Ausrichten“ auf der ersten Injektion und klicken Sie dann auf „Start Automation.“ In der Serien Registerkarte, wählen Sie „Lineale in der Symbolleiste“ passen sieeinen kleinen Bereich der Basislinie unmittelbar vor dem ersten Probeninjektion, und wählen Sie die Option „Null“. Generieren Sie eine .IBMX Datei zur Analyse in dem Scrubber, indem Sie „Export-Datei iBMX“ und klicken Sie dann auf „Start Automation.“ Starten Sie Scrubber und laden Sie die Datei .IBMX. Geben Sie „100n“, wie die „Auf Konz“ und „2“ als „Verdünnungsfaktor“. Crop Daten, entfernen alle Basislinie vor dem Beginn der Injektion, und richten die Bindungskurven zu Beginn der Assoziation. HINWEIS: Für das Single-Cycle-Kinetik Experiment nicht die Kurven ausrichten. Gehen Sie auf die „Kinetics“ Registerkarte, stellen Sie das Lineal für die Einspritzung Endzeit, wählen Sie „k d“ und fit, dann „fix k d.“ Wählen Sie „k a k d“ und passen Sie es erneut. Schwimmer die Kd – Säule und wieder fit , um die Passform zu verfeinern. HINWEIS: Für den Einbau von Single-Cycle-BindungskurvenKlicken Sie auf „Opts“ und „subtrahieren“, dann wählen Sie „Getrennt“ und schweben die „Begin Inj“ Spalte deaktivieren Sie die Assoziation Profile zurück zu einem theoretischen Grundlinie Ursprung passen. Überprüfen Sie die Einbau Kinetik Parameter in der Registerkarte Ergebnisse.