تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي
概要
نحن هنا وصف البروتوكولات لقياس الأجسام المضادة مستضد تقارب وحركية باستخدام أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي تستخدم عادة ملزمة.
Abstract
أجهزة الاستشعار البصرية خالية من التسمية هي أدوات قوية في اكتشاف الأدوية لتوصيف التفاعلات الجزيئية البيولوجية. في هذه الدراسة، وصفنا استخدام أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لتقييم تقارب وحركية عشرة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عالية تقارب (MABS) ضد طليعة البروتين الإنسان كونفيرتاز سبتيليزين نوع كيكسن 9 (PCSK9) ملزمة. بينما تستمد كلا Biacore T100 وProteOn XPR36 من الرنين راسخة بلازمون السطحية (SPR) والتكنولوجيا، الرئيس السابق لديه أربعة تدفق الخلايا متصلة بواسطة التكوين تدفق المسلسل، في حين أن يعرض الأخيرة 36 نقاط رد الفعل في موازاة ذلك من خلال مرتجلة 6 × 6 تتقاطع التكوين قناة ميكروفلويديك. وIBIS MX96 أيضا تعمل على أساس تكنولوجيا الاستشعار SPR، مع ميزة التصوير الإضافية التي تقدم كشف في التوجه المكاني. هذه التقنية الكشف عن جانب التدفق المستمر Microspotter (CFM) توسع الإنتاجية بشكل كبير عن طريق البريدnabling متعددة طباعة مجموعة والكشف عن 96 رياضية رد فعل في وقت واحد. في المقابل، يستند محاذية RED384 على BioLayer التداخل (BLI) مبدأ البصرية، مع تحقيقات الألياف البصرية بوصفها جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن نمط التداخل التغييرات على التفاعلات ملزم على سطح الحافة. على عكس المنصات المرتكزة SPR، لا تعتمد على نظام BLI على FLUIDICS تدفق مستمر. بدلا من ذلك، نصائح استشعار جمع القراءات بينما هم منغمسين في حلول تحليلها من صفيحة 384 بئر خلال التحريض المداري.
كل من هذه المنصات جهاز الاستشعار البيولوجي مزاياه وعيوبه. لتوفير المقارنة المباشرة من قدرة هذه الصكوك على توفير البيانات الحركية الجودة، والبروتوكولات المذكورة توضح التجارب التي تستخدم نفس الشكل فحص ونفس الكواشف ذات جودة عالية للتميز حركية الضد مستضد التي تناسب بسيط 1: 1 نموذج التفاعل الجزيئي .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتبين دراستنا المقارنة وجها لرئيس أن كل منصة جهاز الاستشعار البيولوجي لديه نقاط قوة ونقاط الضعف الخاصة بها. على الرغم من أن الشخصية ملزمة من الأجسام المضادة متشابهة من خلال المقارنة البصرية (أرقام 3-6)، وبالترتيب من الثوابت معدل الحركية المكتسبة ومتسقة للغاية عبر الصكوك (الشكل 7)، تظهر نتائجنا أن الصكوك SPR المستندة مع FLUIDICS تدفق مستمر) هي أفضل حل في التفاعلات عالية تقارب مع معدلات التفكك البطيء. ويلاحظ انحراف التصاعدي خلال مرحلة التفكك في قواعد البيانات (على سبيل المثال، ماب 2، ماب 5، وماب 9؛ الشكل 5) التي تم إنشاؤها من قبل حرة FLUIDICS-أداة BLI. ويمكن أن يعزى هذا الاستنتاج في جزء كبير منه إلى عينة تبخر مع مرور الوقت في صفيحة، وهو الحد الأساسي للنظام. مع هذا القيد الأصيل، ويقتصر الوقت التجريبية أيضا إلى أقل من 12 ساعة. لذا كانت مبرمجة التجارب مع شمرات orter (جمعية 500 ق و 30 دقيقة التفكك) مقارنة مع أولئك من منصات أخرى (جمعية 10 دقيقة و 45 دقيقة التفكك). ومع ذلك، وتقصير الوقت التجريبية لم تظهر للتخفيف من تأثير التبخر على نوعية البيانات / الاتساق، والثوابت معدل الناتجة عن أداة تستند BLI-تظهر أقل الخطي نتيجة للتقلبات في بعض من معدلات (الشكل 8C ). بالإضافة إلى عينة التبخر، وربما ساهمت الاختلافات في الكواشف القبض تستخدم أيضا للاختلافات في النتائج المتحصل عليها. في حين تم استخدام بروتين A / G في جميع منصات SPR الثلاث التي تتخذ من FLUIDICS، واستخدمت أجهزة الاستشعار AHC في منصة BLI غير FLUIDICS. منذ بروتين A / G من المحتمل أن يكون لها تقارب ضعف لMABS مما يفعل AHC، سطح جهاز الاستشعار البيولوجي القائم على الأجسام المضادة، وبعيدا عن معدلات مجمع ماب مستضد من البروتين A / أسطح G قد تظهر بشكل مصطنع أسرع من تلك التي تم الحصول عليها من سطح AHC. ويدعم هذا الاحتمال بذ البيانات التجريبية تبين أن قيم معدل خارج الناتجة عن منصة BLI كانت أقل باستمرار من تلك التي تم الحصول عليها من الأدوات الأخرى (الشكل 7، خط أحمر). ومع ذلك، فإن منصة BLI لها مزايا مختلفة على منصات أخرى. على سبيل المثال، هو درجة عالية من المرونة فيما يتعلق باختيار أجهزة الاستشعار والتكوين الفحص نظرا لمختلف أجهزة الاستشعار قبل المغلفة للاستخدام الفوري. في تجاربنا، واستخدام أجهزة الاستشعار AHC القضاء على الحاجة إلى اتخاذ خطوات يجند الشلل، مما يقلل من الوقت اللازم لإعداد. وعلاوة على ذلك، ومنصة BLI تتطلب صيانة أقل بكثير بالمقارنة مع منصات FLUIDICS SPR الأخرى، والتي تتميز معقدة أنابيب والتبديل قيمة تكوينات. هذه الميزة هي ميزة لالتجارب التي تنطوي على عينات الخام التي يمكن أن تسبب مشاكل انسداد والتلوث.
حيث أن الطلب لتحديد كفاءة، سريع، ودقيق للزيادات المرشحين العلاجية، والحاجة إلى ثنائيةosensor الإنتاجية آخذ في الارتفاع أيضا. بين منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الأربعة، والإنتاجية من جهاز الاستشعار البيولوجي قادرة على 96 يجند طباعة مجموعة هي الأعلى، تليها جهاز الاستشعار البيولوجي إلى جانب ليتنقل شكل 36 يجند وجهاز الاستشعار البيولوجي استنادا BLI مع قراءات في وقت واحد 16 قناة، والتي تزيد في نهاية المطاف عدد التفاعلات قياس في دورة ملزمة واحدة إلى 96 و 36 و 16، على التوالي. هذه القدرات الإنتاجية هي أعلى بكثير من منصة SPR التقليدية، التي تقتصر من خلال وجود أربعة فقط تدفق الخلايا متصلة بواسطة تدفق تسلسلي واحد. منذ شملت تجاربنا مجموعة عينة صغيرة نسبيا من 10 MABS تقييم بكثافة سطح متعددة مع أوقات طويلة التفكك، لعبت دور فعال الانتاجية دورا معتدلا في تحديد كفاءة التجارب. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في الأوقات التجريبية للمنصات عالية الإنتاجية الثلاثة، وفي جميع الحالات تم الانتهاء من التجارب في يوم واحد. من ناحية أخرى، تتطلب التجارب التقليدية SPR تدفق التسلسلي 3 أيام لاستكمال، على الرغم من أتمتة سيرا على الأقدام من الحصول على البيانات بعد الإعداد. في الدراسات الأخرى التي تنطوي على عدد كبير من العينات (أي في مئات أو آلاف)، لأغراض ترتيب معدل خارج / الفحص الحركي أو binning حاتمة، تصبح الإنتاجية عاملا حاسما.
على الرغم من أن الإنتاجية في IBIS MX96 هي أوامر من حجم أعلى من ذلك من أجهزة الاستشعار الأخرى، وبالتالي هي الخيار الأمثل لهذه الأغراض، ولديها بعض أوجه القصور. على وجه الخصوص، وطباعة مجموعة من CFM تظهر التناقضات سطح الكبيرة (الشكل 1) وانخفاض استنساخ البيانات (الشكل 8D و8E). لقياس حركية دقيقة، ومقدار يجند على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي معلمة الحرجة التي تحتاج إلى رقابة لضمان أن ردود ملزمة ليست منزعجة من العوامل الثانوية مثلنقل الجماعي أو عائق الفراغية. لBiacore T100 وProteOn XPR36، تم تحديد مستويات L الأمثل R على أساس حساب معيار القيم ماكس مجموعة R كما هو موضح في المادة 17 البحوث. من ناحية أخرى، لمنصات محاذية RED384 وIBIS MX96، وتم تحقيق مستويات القبض ماب تجريبيا باستخدام سلسلة من الأجسام المضادة 2 أضعاف المخفف متسلسل في أوقات ثابتة. أدى عدم المعرفة أو السيطرة على خطوة القبض في سطح ذات الكثافة السكانية العالية وإشارات عالية ملزمة استجابة (الشكل 2) التي قد يؤثر سلبا على دقة الثوابت معدل الحركية. وعلاوة على ذلك، وفصل الطابعة من كشف SPR يعرض أيضا تحديا عند إجراء قياسات متعددة دورة الملزمة التي تنطوي على regenerations. وكانت الطريقة الوحيدة لتنفيذ الإعداد حركية متعددة دورة من خلال اقتران أمين المباشر للMABS، بدلا من القبض على طريق ماب التيسير من قبل يجمد بروتين A / Gالسطح في منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الثلاثة الأخرى. ونتيجة لذلك، كان مطلوبا تجربة إضافية تجديد الكشفية لتحديد الظروف المثلى تجديد. ارتبط نتيجة هذا الإعداد إلى ~ انخفاض 90٪ النشاط الملحوظ سطح بالمقارنة مع التيسير طريقة القبض على (الشكل 9)، بالإضافة إلى وقت أطول التجريبية. لتنفيذ أسلوب القبض على التيسير، اعتمد هذا النهج الحركي البديلة دورة واحدة. وينطوي هذا النهج على حقن متتابعة من تحليلها إلى زيادة تركيزات دون تجديد بين كل حقنة (الشكل 2). هذا النهج مريحة للغاية، ولكن أقل تطبق عادة ليس فقط تقصير الوقت التجريبية وخفض استهلاك كاشف، ولكن أيضا إنتاج الثوابت معدل الحركية مشابهة جدا لتلك من أجهزة الاستشعار الأخرى (الشكل 7). ولذلك، فإن تطبيق هذا النهج حركية واحدة دورة يتغلب على قيد التكوين الطبيعي للدول الصك ويقدم لفرصة للحصول على عالية الدقة الحركية الثوابت معدل بطريقة عالية الإنتاجية.
وعلى الرغم من الإنتاجية كونه قيدا رئيسيا في Biacore T100، نتائجنا تظهر بشكل جماعي أنها ولدت البيانات أكثر اتساقا مع أعلى مستويات الجودة. وأعقب ذلك في ProteOn XPR36، التي لديها أعلى ~ 10 أضعاف الإنتاجية. قدرتها على توليد بيانات عالية الجودة يصبح ميزة عند تميز عالية تقارب التفاعلات الضد مستضد التي يمكن أن يكون تحديا تقنيا عند الوصول إلى حدود الكشف الصكوك. في حين أن القيود المنهجية في الأجهزة من محاذية RED384 تعيق القياس الدقيق للثوابت معدل التفكك (أي مقصر من حساسية لحل كافية تسوس إشارة لبطء خارج الرسوم)، فإن كلا من Biacore T100 وProteOn XPR36 يمكن أن توفر حساسة وموثوق بها الكشف عن التمايز.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر نواه ديتو وآدم مايلز للحصول على المساعدة الفنية على IBIS MX96.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
参考文献
- Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
