Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi
概要
Burada tarif afinite ve dört yaygın biçimde kullanılan biyosensör platformları kullanarak kinetiği bağlayıcı antikor-antijen ölçümü için protokolleri.
Abstract
Etiket içermeyen optik biyosensörler biomoleküler etkileşimlerin karakterizasyonu için ilaç keşfi güçlü araçlardır. Bu çalışmada, bağlanma afinitesi, insan minimal bölünme sinyalini hatırlatmaktadır subtilisin kexin tip 9 karşı on yüksek afiniteli monoklonal antikorlar (mAb'ler) (PCSK9) kinetiklerini değerlendirmek için laboratuarda dört rutin olarak kullanılan biyosensör platformları kullanılmasını tarif eder. Biacore T100 ve ProteOn XPR36 hem köklü Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) teknolojisi elde edilir olsa da, önceki yapımı bir 6 x 6 CrissCross ile paralel Bu tutucu ise 36 Reaksiyon noktalar, seri akış konfigürasyonu ile bağlı dört akış hücresinin sahip mikroakışkan kanal konfigürasyonu. IBIS MX96 da mekansal yönlenmede algılama sağlayan ek bir görüntüleme özelliği ile, SPR sensor teknolojisine dayalı olarak çalışır. Sürekli Akış Microspotter (CFM) ile bağlandığında, bu algılama tekniği e oranını önemli ölçüde genişletirAynı anda 96 reaksiyon sporları çoklu dizi baskı ve algılama nabling. Bunun aksine, Sekizli RED384 fiber optik prob girişim deseni tespit etmek için biyosensör olarak hareket ile BioLayer İnterferometri (BLI) optik prensibine dayanan uç yüzeyinde etkileşimleri bağlanması üzerine değişir. SPR tabanlı platformlar farklı olarak, BLI sistemi sürekli akış akıskanlar tekni˘gi dayanmaz; onlar yörünge ajitasyon sırasında 384 mikroplakanın analit çözümleri dalmış iken yerine, sensör ipuçları okumaları toplar.
Bu biyosensör platformları her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. 1 moleküler etkileşim modeli: anlatılan protokoller basit 1 uygun bir antikor-antijen kinetiği karakterize etmek için aynı deney formatı ve aynı yüksek kalitede reaktif maddeleri deneyleri göstermektedir kalite kinetik veri sağlamak için bu araçların kabiliyetinin doğrudan karşılaştırma sağlamak için .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bizim kafa kafaya karşılaştırma çalışması her biyosensör platformu kendi güçlü ve zayıf yönleri olduğunu gösteriyor. Antikorların bağlanma profilleri (Şekiller 3-6), karşılaştırma yapılarak benzer olsa da, ve elde edilen kinetik hız sabitleri sıra düzeni aletleri üzerinde oldukça tutarlıdır (Şekil 7), elde edilen sonuçlar ile aletleri SPR dayalı olduğunu göstermektedir sürekli akış flüidik) yavaş ayrılma hızlarına sahip, yüksek afiniteli etkileşimler çözülmesi daha iyidirler. Ayrışma safhasında yukarı sürüklenme veri setleri gözlemlenmektedir (örneğin, mAb 2 mAb 5 ve mAb 9; Şekil 5) BLI flüidik içermeyen cihaz tarafından oluşturulan. Bu bulgu, sistemin bir birincil kısıtlamasıdır mikroplakanın, zaman içinde örnek buharlaştırma için büyük ölçüde atfedilebilir. bu içsel sınırlılığı, ile, deneme süresi de en az 12 saat ile sınırlandırılmıştır; Bu yüzden deneyler sh programlandıÖrter kez diğer platformlara kişilerce (10 dakika birlikte ve 45 dakika ayrışma) ile karşılaştırıldığında (500 s birleşme ve 30 dakika ayrışma). BLI tabanlı alet tarafindan üretilen hızı sabitleri, off-hızları bazı dalgalanmalar sonucu (Şekil 8C gibi daha az doğrusallığı gösteren Ancak, deney süresini kısaltarak, veri kalitesi / tutarlılık buharlaştırma etkilerini hafifletmek için görünmedi ). Örnek buharlaştırma ek olarak, kullanılan tutucu reaktifler farklılıklar da elde edilen sonuçlar farklılıklar katkıda bulunmuş olabilir. Protein A / G, tüm üç flüidik tabanlı SPR platformlarında kullanılan iken, AHC sensörleri olmayan flüidik BLI platformu kullanılmıştır. Protein A / G AHC, bir antikor-bazlı biyosensör yüzey protein A / G yüzeylerinden mAb antijen kompleksinin dışı oranları yapay olarak daha hızlı görünebilir yaptığından daha mAb için daha zayıf bir afiniteye sahip muhtemel olduğundan AHC yüzeyden elde edilmiştir. Bu olasılık, b desteklenirY BLI platformu tarafından oluşturulan kapalı-hızı değerleri için diğer araçlar (Şekil 7, kırmızı çizgi) elde edilenlere nazaran tutarlı şekilde daha düşük olduğunu gösteren deneysel veriler. Bununla birlikte, BLI platformu diğer platformlara üzerinde farklı avantajlara sahiptir. Örneğin, bunun nedeni hemen kullanım için çeşitli ön kaplanmış sensörler, sensör seçimi ve deney konfigürasyonu ile ilgili olarak yüksek derecede esnektir. Deneylerde, AHC sensör kullanımı hazırlama süresini azaltmak, ligand immobilizasyon proseslerine olan ihtiyacı ortadan kaldırmıştır. Bundan başka, BLI platformu karmaşık boru ve değer anahtarı yapılandırmaları özelliği diğer flüidik SPR platformları ile kıyaslandığında çok daha az bakım gerektirir. Bu özellik tıkanma ve kirlilik sorunlarına neden olabilir ham örneklem içeren deneyler için bir avantajdır.
Terapötik adaylar artar, verimli, hızlı ve doğru tanımlama için talep, bi ihtiyacı olarakosensor verim de artıyor. Dört biyosensör platformlar arasında, 96-ligand dizi baskı yapabilen bir biyosensör ile ilgili verim sonuçta artış bir crisscrossing 36-ligandı biçimi ve 16 kanallı eş zamanlı okuma ile BLI bazlı biyosensör bağlanmış biyosensör ile en yüksek olup sırasıyla 96, 36 ve 16 için tek bir bağlanma döngü ölçülen etkileşim sayısı. Bu verim özellikleri olan tek bir seri akım ile bağlı dört akış hücrelere sahip ile sınırlıdır geleneksel SPR platform, önemli ölçüde daha yüksektir. Bizim deneyler uzun ayrılma süreleri ile çok sayıda yüzey yoğunlukları değerlendirilen 10 mAb'nin nispeten küçük bir numune seti dahil olduğundan, enstrümantal çıktılar deneyler verimliliğinin belirlenmesinde ılımlı bir rol oynamıştır. Üç yüksek verimlilik platformların deneysel zamanlarda önemli bir fark vardı ve her durumda deneyler bir günde tamamlanmıştır. Öte yandan, geleneksel seri akış SPR deneyleri kurulumdan sonra veri toplama yürüyüş uzağa otomasyon rağmen tamamlamak için 3 gün gerektiriyordu. Off-rate sıralaması / kinetik tarama ya da özüdür kümeleştirme amaçlı, (yüzlerce hatta binlerce yani) örneklerin çok sayıda içerir diğer çalışmalarda, üretilen iş kritik bir faktör haline gelir.
IBIS MX96 içinde üretilen iş diğer biyosensörlerinin o birkaç kat daha yüksektir ve bu nedenle bu amaçlar için en uygun seçimdir rağmen, birkaç eksiklikleri vardır. Özellikle, CFM ile dizi baskı büyük yüzey tutarsızlıklar (Şekil 1) ve düşürülmüş veri tekrarlanabilirliği (Şekil 8D ve 8E) göstermektedir. doğru kinetik ölçümler için, biyoalgılayıcı yüzey üzerinde ligand miktarı bağlanma tepkileri gibi ikincil faktörlere bozulmazlar sağlamak için kontrol edilmesi gereken kritik bir parametre olduğukütle transferi ya da sterik engelleme. Biacore T100 ve ProteOn XPR36 için en uygun RL seviyeleri araştırma makalesinde 17'de tarif edildiği gibi resim Rmax değerlerinin standart hesaplanması ile belirlenmiştir. Öte yandan, Sekizli RED384 ve IBIS MX96 platformları için mAb yakalama seviyesi ampirik sabit zamanlarda 2-kat seri olarak seyreltilmiş bir antikor serileri kullanılarak elde edildi. Bilgi veya yakalama aşamasının kontrol eksikliği, yüksek yoğunluklu yüzey ve kinetik hız sabitleri doğruluğunu tehlikeye olabilir yüksek bağlanma cevap sinyalleri (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. rejenerasyon içeren çok sayıda bağlanma döngüsü ölçümleri gerçekleştirirken Ayrıca, SPR detektörden gelen yazıcı ayrılması da zordur. çoklu döngüsü kinetiği kurulum gerçekleştirmek için tek yol immobilize edilmiş Protein A / G ile mAb Fc ile ele karşı mAb'ler direkt amin birleştirme yoluyla olduDiğer üç biyosensör platformlarda yüzeyi. Bunun bir sonucu olarak, ek bir rejenerasyon keşif deney optimum dönüşüm koşulları belirlemek için gerekli oldu. Bu kurulum sonucunun daha uzun bir deneme süresinden ek olarak Fc yakalama yöntemi (Şekil 9) ile karşılaştırıldığında bir ~% 90, daha düşük gözlenen yüzey aktivitesi bağlantılıydı. Fc yakalama yöntemi yürütmek için, alternatif bir tek döngüsü kinetik yaklaşım benimsenmiştir. Bu yaklaşım, her bir enjeksiyon (Şekil 2) arasında, yenileme olmaksızın artan konsantrasyonlarda analitin sıralı enjeksiyon içerir. Bu son derece uygun, fakat daha az yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım, sadece deney süresi kısaltılabilir ve reaktif tüketimi düşük değil, aynı zamanda diğer biyosensörler (Şekil 7) elde edilenlere benzer yüksek kinetik hız sabitleri üretti. Bu nedenle, bu tek döngüsü kinetiği yaklaşımı uygulanarak aletin doğal yapılandırma sınırlama üstesinden gelir ve sunuluryüksek verimli bir şekilde yüksek çözünürlüklü kinetik hız sabitlerinin elde etmek için bir fırsat.
üretilen iş Biacore T100 önemli bir sınırlama olmasına rağmen, sonuçlarımız topluca en yüksek kalite ile en tutarlı veri oluşturulan olduğunu göstermektedir. Bu ~ 10-kat daha yüksek bir kapasiteye sahip olmasına ProteOn XPR36 izledi. araçların tespit limitleri ulaşıldığında teknik olarak zor olabilir yüksek afiniteli antikor-antijen etkileşimlerini karakterize Yüksek kalitede verileri oluşturmak için kabiliyetleri bir avantajdır. Sekizli RED384 arasında enstrümantasyon sistematik sınırlamalar ayrılma oran sabitleri doğru ölçüm engel ise (yani, duyarlılık altında kalan yavaş off-hızları için yeterli sinyal çürüme gidermek için), her iki Biacore T100 ve ProteOn XPR36 hassas ve güvenilir sağlayabilir farklılaşması için tespiti.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar IBIS MX96 üzerinde teknik yardım için Noah Ditto ve Adam Miles teşekkür ederim.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
参考文献
- Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
