Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor
概要
Nós descrevemos aqui os protocolos para a medio de anticorpo-antigénio de afinidade e cinética utilizando quatro plataformas de biossensores de ligação geralmente usados.
Abstract
biossensores ópticos, livre de marcador são ferramentas poderosas para a descoberta de drogas para a caracterização de interacções biomoleculares. Neste estudo, descrevemos o uso de quatro plataformas de biossensor utilizados rotineiramente no nosso laboratório para avaliar a afinidade de ligação e da cinética de dez anticorpos de elevada afinidade monoclonais (mAbs) contra pró-proteína humana convertase subtilisina Kexin tipo 9 (PCSK9). Embora ambos Biacore T100 e Proteon XPR36 são derivados a partir da tecnologia (SPR) bem estabelecida ressonância plasmónica de superfície, o primeiro tem quatro células de fluxo ligados por configuração de fluxo em série, enquanto que o último presentes 36 pontos de reacção em paralelo, através de um improvisado 6 x 6 cruzado configuração do canal microfluídico. O MX96 IBIS também opera com base na tecnologia de sensor de RPS, com uma característica adicional de imagem que proporciona detecção de orientação espacial. Esta técnica de detecção, juntamente com o fluxo contínuo Microspotter (CFM) expande-se o rendimento de forma significativa por enabling impressão matriz multiplex e de detecção de 96 desportos de reacção simultaneamente. Em contraste, o octeto RED384 baseia-se no princípio BioLayer interferometria (BLI) óptico, com sondas de fibra óptica agindo como o biossensor para detectar o padrão de interferência muda em cima de interacções de ligação na superfície da ponta. Ao contrário das plataformas baseadas em SPR, o sistema BLI não dependem de fluidos de fluxo contínuo; em vez disso, as pontas de sensor recolher leituras enquanto eles estão imersos em soluções de analito de uma microplaca de 384 cavidades durante a agitação orbital.
Cada uma dessas plataformas biossensor tem suas próprias vantagens e desvantagens. Para proporcionar uma comparação directa da capacidade desses instrumentos para fornecer dados cinéticos de qualidade, os protocolos descritos ilustram experiências que utilizam o mesmo formato de ensaio e os mesmos reagentes de alta qualidade para a caracterização cinética de anticorpo-antigénio que se encaixam a simples 1: modelo de interacção molecular 1 .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nosso estudo de comparação head-to-head mostra que cada plataforma biosensor tem suas próprias forças e fraquezas. Embora os perfis de ligação dos anticorpos são semelhantes por comparação visual (Figuras 3 – 6), e a ordem de classificação das constantes cinéticas adquiridos são altamente consistentes entre os instrumentos (Figura 7), os nossos resultados mostram que os instrumentos SPR-base com fluidos de fluxo contínuo) são melhores em resolver interacções de elevada afinidade com taxas de dissociação lentas. Deriva para cima durante a fase de dissociação é observado em conjuntos de dados (por exemplo, mAb 2, 5 mAb, e o mAb 9; Figura 5) gerado pelo BLI fluídica-livres instrumento. Esta descoberta pode ser atribuído, em grande parte para a evaporação da amostra ao longo do tempo na microplaca, que é uma limitação principal do sistema. Com esta limitação inerente, o tempo experimental é também restringido a menos de 12 h; os ensaios foram, por conseguinte, programado com shvezes Orter (associação 500 s e 30 min de dissociação) em comparação com os das outras plataformas (10 min de associação e de dissociação de 45 min). No entanto, o encurtamento do tempo experimental não pareceu atenuar o impacto da evaporação sobre a qualidade dos dados / consistência, como as constantes de velocidade gerado pelo instrumento baseado no BLI mostrar menos linearidade como um resultado de flutuações em alguns dos off-rates (Figura 8C ). Além disso a evaporação de exemplo, diferenças nos reagentes de captura utilizados podem ter também contribuiu para as diferenças entre os resultados obtidos. Enquanto protea A / G foi utilizada em todas as três plataformas SPR fluídicos baseada, sensores AHC foram usadas na plataforma BLI não-fluidos. Uma vez que a proteína A / G é provável que tenha uma afinidade mais fraca para os mAbs que se o AHC, uma superfície de biossensor baseado em anticorpos, os off-rates do complexo mAb-antigénio a partir das / superfícies proteína A G pode artificialmente aparece mais rapidamente do que aqueles obtida a partir da superfície de AHC. Esta possibilidade é suportado by os dados experimentais que mostram que os valores de taxa de dissociao gerados pela plataforma BLI foram consistentemente mais baixos do que os obtidos a partir de outros instrumentos (Figura 7, linha vermelha). No entanto, a plataforma BLI tem vantagens diferentes sobre as outras plataformas. Por exemplo, é altamente flexível no que diz respeito à escolha do sensor e a configuração do ensaio devido às diferentes sensores pré-revestido para uso imediato. Nas nossas experiências, a utilização dos sensores AHC eliminou a necessidade de etapas de imobilização de ligando, reduzindo o tempo de preparação. Além disso, a plataforma BLI requer muito menos manutenção em comparação com as outras plataformas fluidos SPR, que apresentam configurações de tubos e interruptor valor complicados. Esta característica é uma vantagem para as experiências envolvendo amostras em bruto, que podem causar problemas de entupimento e de contaminação.
Como a demanda para a identificação eficiente, rápida, e precisa de candidatos terapêuticos aumenta, a necessidade de biosensor rendimento está também a aumentar. Entre as quatro plataformas de biossensor, a taxa de transferência do biossensor capaz de 96-ligando de impressão de matriz é o mais elevado, seguido pelo biossensor acoplado a um formato de 36-ligando de entrecruzamento e o biossensor baseado no BLI com leitura simultânea de 16 canais, que em última análise aumentar o número de interacções medidos num único ciclo de atadura para 96, 36 e 16, respectivamente. Estas capacidades são rendimento significativamente mais elevado do que a da plataforma SPR tradicional, que é limitada por ter apenas quatro células de fluxo ligadas por um único fluxo de série. Uma vez que as nossas experiências envolveram um conjunto relativamente pequeno de amostra de 10 mAbs avaliados em várias densidades de superfície com tempos de dissociação longa, os débitos instrumentais desempenhou um papel moderado na determinação da eficiência das experiências. Não houve diferenças significativas nos tempos experimentais das três plataformas de alto rendimento, e em todos os casos, os ensaios foram concluídos em um dia. Por outro lado, os experimentos tradicionais SPR fluxo de série necessário 3 dias para ser concluído, apesar da automação pé-away de aquisição de dados após a instalação. Em outros estudos que envolvem um grande número de amostras (isto é, na ordem das centenas ou milhares), para fins de classificação off-rate / rastreio cinética ou binning epitopo, a taxa de transferência torna-se um factor crítico.
Embora a taxa de transferência no IBIS MX96 é ordens de magnitude mais elevada do que a dos outros biossensores e é portanto uma escolha ideal para esses fins, ele tem alguns inconvenientes. Em particular, a impressão de matriz pelo CFM mostra grandes inconsistências na superfície (Figura 1) e reduzida reprodutibilidade dos dados (Figura 8D e 8E). Para as medições cinéticas exactas, a quantidade de ligando na superfície do biossensor é um parâmetro crítico que deve ser controlado para assegurar que as respostas de ligação não são perturbados por factores secundários tais comotransferência de massa ou impedimento. Para o Biacore T100 e Proteon XPR36, os níveis óptima R L foram determinadas com base no cálculo de valores padrão no máximo conjunto R, tal como descrito no artigo de investigação 17. Por outro lado, para as plataformas Octeto RED384 e IBIS MX96, os níveis de captura de mAb foram obtidos empiricamente utilizando uma série de anticorpos 2 vezes diluídas em série em tempos constantes. A falta de conhecimentos ou de controlo do passo de captura resultou em uma superfície de alta densidade e os sinais de altos de ligação de resposta (Figura 2) que pode ter comprometido a precisão das constantes cinéticas. Além disso, a separação da impressora a partir do detector de SPR também apresenta um desafio ao realizar várias medições de ciclo de ligação envolvendo regenerações. A única maneira de fazer a configuração multi-cinética do ciclo foi através de acoplamento de amina directa dos mAbs, em oposição a capturar pelo mAb Fc pela proteína A imobilizada / Lsuperfície nas outras três plataformas de biossensor. Como resultado, uma experiência de regeneração de aferição adicional foi necessário para determinar as condições de regeneração óptimas. O resultado desta configuração foi associada a uma actividade de superfície observado 90% inferior ~ em comparação com o método de captura de Fc (Figura 9), para além de um tempo mais longo experimental. Para executar o método de captura de Fc, foi adoptada uma abordagem cinética de ciclo único alternativa. Esta abordagem envolve a injecção sequencial de analito em concentrações crescentes, sem regeneração entre cada injecção (Figura 2). Esta abordagem altamente conveniente, mas menos vulgarmente aplicados não só reduziu o tempo experimental e a redução do consumo de reagente, mas também produzido constantes cinéticas altamente semelhantes aos de outros biossensores (Figura 7). Portanto, a aplicação desta abordagem cinética de ciclo único ultrapassa a limitação inerente configuração do instrumento e apresenta umaoportunidade para a obtenção de alta resolução das constantes cinéticas de um modo de elevado rendimento.
Apesar do rendimento ser uma grande limitação no Biacore T100, nossos resultados mostram coletivamente que gerou os dados mais consistentes com a mais alta qualidade. Isto foi seguido pela Proteon XPR36, que tem ~ 10 vezes maior rendimento. A sua capacidade para gerar dados de alta qualidade torna-se uma vantagem ao caracterizar interacções anticorpo-antigénio de alta afinidade que podem ser tecnicamente difícil quando os limites de detecção dos instrumentos são atingidos. Enquanto as limitações sistemáticas na instrumentação do octeto RED384 dificultam a medição precisa das constantes de velocidade de dissociação (ou seja, ficar aquém da sensibilidade para resolver decaimento de sinal suficiente para lenta off-rates), tanto o Biacore T100 e Proteon XPR36 pode fornecer sensível e confiável detecção para a diferenciação.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Noah Ditto e Adam Miles de assistência técnica no IBIS MX96.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
参考文献
- Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
