四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

1.タンパク質および抗体以前に17を説明したようにタイプ9（PCSK9）ケキシンヒトプロタンパク質転換酵素サブチリシン及び10のマウス由来抗PCSK9モノクローナル抗体を産生し、精製。 順次UPLCシステム19を使用して、分析用サイズ排除（SEC）カラムに各試料の10μgのを注入することにより精製された産物の純度を評価します。 ビアコアT100 2.動的測定 インストゥルメントおよび試薬の調製 15分間室温でCM5センサーチップを平衡化。 200mMの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）、室温で50mMのN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）の2つの200μLアリコート二200μLのアリコートを解凍。 1×HBS-EP（10mMのHEPES [pHを7.4]、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.005％v / vのポリソルベートP20）ジによるランニング緩衝液の1リットルのボトルを製造水で10倍HBS-EP +原液を合着。 HBS-EPランニング緩衝液中0.063μgの/ mLで10mM酢酸ナトリウム（pH4.5）中で30μgの/ mLでプロテインA / Gの1ミリリットルを用意し、各mAbサンプルの500μL。氷の上のヒトPCSK9の凍結バイアルを解凍します。 制御ソフトウェアでは、クリックして「ツール|イジェクトチップ」は、シースと密接にセンサチップを配置します。 、室内温度としてC°分析温度などのC°「25」を入力し、「10」|「設定温度ツール」をクリックしてください。 表面固定化 「|新しいウィザードテンプレート/ファイルを開く」と左側のパネルのリストから、「固定化」を選択する制御ソフトウェアでは、クリックしてください。 固定設定ウィンドウを入力して、「新規作成」をクリックします。チップタイプとして「CM5」を選択し、サイクル当たり「1」のフローセルを選択。 次の各ACTIVAに「フローセル1/2/3/4を固定する」のチェックボックスをオンにしオプションをしte。すべてのフロー・セルのための方法として、また「アミン」「固定化レベルを目指す」を選択します。 リガンドとして「を30μg/ ムル・プロア / G」を入力し、目標レベルは、フローセルの全ては、「10000」応答単位（RU）に設定されていることを保証します。 「実行前首相」を確認し、「次へ」をクリックしてください。 「2ラック試薬」を選択し、それに応じて個々の試料バイアルに試薬ピペットの場所を定義します。バック機器をラックに挿入し、「スタート」をクリックして、実行を開始するために保存する実験名を入力します。 検体は、バインディングと再生サイクル 「|新規メソッド/ファイルを開く」、「HU PCSK9に結合する20140812 HU抗PCSK9 IgGを」を選択し、メソッドを開く]をクリックします。メソッドのパラメータを確認します。 「アッセイ手順」において、パープ」で選択された「サンプル」との名称である「HU PCSK9」は、10サイクルがあることを確認OSEは 『1」。複製番号がに設定されています』。 「サイクルタイプ」で、「2」、流路にわたってキャプチャ1のために、「220」秒の接触時間を設定し、「110」のキャプチャ2の流路にわたって「3」、流路にわたってキャプチャ3は、「55」の"4"。流量は、キャプチャサイクルのすべてのための「10」μL/分です。 「サンプル1」を選択し、変数として「サンプル・ソリューション」をご確認ください。 「600」の解離時間を「1、2、3、4」の流路上「2700」Sに接触時間を設定します。流量は「30」μL/分に設定されています。 溶液フィールドに「グリシン-HCl pHが1.5」を入力し、「20」の流路上の「1、2、3、4」との接触時間を設定し、「再生1」を選択します。 "変数の設定" で、 "100 nMの – 6.25 nMで" の2倍滴定濃度を入力サイクル1-3のために、 "50 nMの – 3.12 nMの" サイクル4-8のために、 "5 nMの – 0.323 nMで" Fまたはサイクル9-10。 「セットアップファイル名を指定して実行」、検出流路を選択し、「2-1、3-1、4-1」では、「次へ」をクリックし、「実行前総理」をチェックし、「次へ」をクリックしてください。 「1ラック検体と試薬」を選択し、それに応じて個々の試料バイアルに試薬ピペットの場所を定義します。機器をラックに挿入し、「スタート」をクリックして、実行を開始するために保存する実験名を入力します。 BIA評価を使用したデータの分析 「速度論/親和性|表面がバインド」をクリックし、Fcと選択し、「2-1」、「3-1」、または「4-1」別に、様々な分析物濃度から表示された曲線と同様に「ゼロ」のすべてをチェック濃度のブランク。 バッファのブランクを差し引い曲線を得るために、「次へ」をクリックしてください。フィット運動parameを得るために：「1バインディング1」モデル、および「フィット」をクリックし、「動態は、」選択しクリックしてくださいTERS。 複数のmAbの表面のグローバルフィッティングについては、下にある「複数のR 最大 」 をクリックし、リストに同じモノクローナル抗体のために他からFcsからの結合曲線を追加します。 結合曲線を差し引いバッファブランクの全てを取得するために、「次へ」をクリックしてください。 「：1バインディング1」モデルを、グローバルに装着動態パラメータを取得するためのパラメータで各R maxの「ローカルフィット」を選択すると選択「カイネティックス」をクリックしてください。 ProteonのXPR36 3.反応速度測定 インストゥルメントおよび試薬の調製 GLMセンサチップとPBS-T-EDTAの2-Lボトル（PBS [pH7.4の]、0.005％のTween-20、および3mMのEDTA）を室温で15分間ランニング緩衝液を平衡化。 制御ソフトウェアでは、「取り出し」して、GLMチップを挿入します。チップ温度℃〜「25」とオートサンプラー温度℃〜「10」に設定。「グリセロールの初期化」をクリックして、チップを初期化するように要求指示に従ってください。 「ファイル|開く」をクリックし、リストから前処理プロトコルを、96ウェルプレートに溶液を調製します。次に、「ファイル名を指定して実行」をクリックし、プロトコルを選択し、「開始」をクリックします。 400mMのEDCの1 mLのアリコートを、室温で100mMのN-ヒドロキシ（スルホ-NHS）の1mLのアリコートを解凍。 PBS-Tで0.25 / mlの、0.125 / mlの、および0.063μgの/ mLで10mM酢酸ナトリウム（pH4.5）中で60μgの/ mLでプロテインA / Gの2ミリリットルを用意し、各mAbサンプルの500μLバッファを実行している-EDTA。氷の上のヒトPCSK9の凍結バイアルを解凍します。 固定化、分析物は、バインディングと再生 「|新|新しいプロトコルファイル」をクリックしてください。 「設定」で、実験名を入力し、「GLM」チップを選択し、「マイクロプレート」を選択し、「2.2」mL容量を入力します。 選択"プロトコル|サンプル"、F1-F6における "不活性化剤" として、G1-G6において "リガンド" とウェルH1-H6、 "プロテインA / G" の "活性化剤" として "エタノールアミン" "EDC /スルホ-NHS" を定義"C1-C6であり、 "リガンド検体" として "ヒトPCSK9 "として" ブランク" として "E1-E6で "再生器"、PBS-T-EDTAとして、 "グリシン"" D1-D6において、" モノクローナル抗体Xのサンプル第二の96ウェルプレート中のウェルH1-H6です。 「手順」、「プロトコル・エディタ」でダブルクリックし、「固定化」を選択し、手順は「30」μLの流速で3次の水平EDC /スルホ-NHSの注射、プロテインA / G、および1 Mエタノールアミンをそれぞれ含みます/分であり、「300」秒の接触時間。 「再生成」をクリックし、PBS-T-EDTAの二つの「60」-sパルスに続いて水平方向と垂直方向の両方に「100」μL/分のグリシンの三つの「18」-sパルス液（pH 1.5）、注入"25" μL/分また、両方向インチ 「リガンド」をクリックし、「25」μL/ minの流速及び「160」秒の接触時間を用いて、垂直方向におけるmAb 2のmAb 1を注入します。 その後会合時の「600」のための「40」μL/ minで、ヒトPCSK9（2倍連続希釈で6.25 nmの100 nm）を同時に6つの水平チャネル上ブランク緩衝液の5つの濃度を注入し、「分析物」をクリック解離時間の「2700」のことで。 「再生成」をクリックし、水平方向と垂直方向の両方に「100」μL/分のグリシンの二つの「18」-sパルス液（pH 1.5）を注入します。 残りのmAb各結合サイクルの後、上記の手順を繰り返します。 注：100 nMのに加えて – 6.25 nMでヒトPCSK9濃度シリーズ、25 nMの – 1.56 nmおよび5nMの – 0.313 nMの濃度系列が使用されます。 試薬の位置に応じて2枚の96ウェルプレートにサンプルおよび試薬を準備ステップ3.2.2で定義され、その後、「ファイル名を指定して実行」タブをクリックし、プロトコル/実験を選択し、「開始」をクリックします。 Proteonのマネージャを使用したデータ分析 「パネルタイプ」をクリックし、「分析物」を選択します。そして、「プロトコルのステップ」をクリックして、リスト内のすべての結合曲線を選択します。 「|チャンネルリファレンス| Interspotプロセス」「自動プロセス」をクリックして、[OK]をクリックします。そして、「|ダブルリファレンス|行| A6プロセス」をクリックしてください。 動態解析のための3つのすべての面で各mAbのための個別のデータセットを保存するために、「データセットを作成」をクリックします。 「分析データセット」をクリックして、各mAbのデータセットを強調表示し、「分析|キネティック」をクリックしてください。 「ラングミュア」モデルと「同時KA / KD」を選択し、「次へ」をクリックしてください。 会合及び解離フィット範囲の両方を強調表示し、「ローカル」R 最大を選択し、取得するためにフィットを実行するために、「次へ」をクリックフィット動力学的パラメーター。 上記の手順を繰り返すが、リガンド表面活性を計算するための実験的なR max値を得るために、フィッティングのために、「グループ化」R maxを選択します。 オクテットRED384 4.動的測定 試薬と試料プレートの準備 1X KB 50mLのPBSで10倍ストック溶液を希釈し（PBS pHを[7.4]、0.02％Tween-20を、0.1％のアルブミン、および0.05％アジ化ナトリウムを含むキネティック緩衝液）を調製。 ウェル当たり200μLで96ウェルプレートに1×KBを分配します。少なくとも10分間、これらの個々のウェルに水和物48抗ヒト捕捉（AHC）バイオセンサーチップ。 2倍連続希釈において1.56 nmの各mAbの1×KB中に20μg/ mLで、10 / mlの、および5μg/ mLのサンプル、ならびに100 nMの7つの滴定濃度でヒトPCSK9を準備します。 384ウェル傾斜底マイクロプレートへのmAbサンプルをロード（REFE試薬プレートとRRED）とウェル当たり90μLでサンプルプレートと呼ばれる別の384ウェルマイクロプレート（）へのヒトPCSK9溶液。 1X KBとサンプルプレート内のウェル中のグリシン（pHは1.5）溶液の負荷一連。 注：これらの1x KBウェルはチップの前処理、ベースラインの安定化、および分析物の解離のために使用されています。グリシン溶液を再生するために使用されています。 実験方法の設定 データ収集ソフトウェアでは、「|新しい実験ウィザード|新しい動態実験|基本動態実験」をクリックします。 「プレートの定義」では、サンプルの種類と位置を定義するには、以下の手順に従ってください。 「16」チャンネルと「384ウェル」形式を選択します。 一度に16個のウェルを強調するために十分で左クリックしながらShiftキーを押しながらプレートディスプレイ内のサンプルと試薬の位置を定義します。 上の右クリックウェルは、mAbサンプルを含むとAHCセンサにmAbがロード（又は捕捉）されるステップを示すために「ロード」を選択します。右側のテーブルでのmAb名と濃度を入力します。 右ヒトPCSK9を含有するウェルをクリックして、mAbを捕捉センサが浸漬され、結合相互作用が測定されるステップを示すために、「サンプル」を選択します。右側の表に相当するモル濃度を入力します。 「緩衝液」または「中和」、および「再生」としてグリシンを含有するウェルとして1X KBを含むウェルを画定します。 「アッセイの定義」では、実験を定義するには、以下の手順に従います。 クリック3」、「30」の時間でリストに「ベースライン」、「再生」、「平衡」、「ロード」、「協会」、および「解離」の手順を「追加」を選択0" 、 "18" 秒、 "200" 秒、 "500" 秒、及び "1800" の、それぞれ振れ速度が "1000" RPM。 「アッセイ手順リスト」にステップを追加するには、ステップの最初のクリック、その後、サンプルや試薬プレートのいずれかに位置井戸をクリックしてください。手順は次のとおりです。 平衡回生：グリシンに「15」-sディップ液（pH 1.5）、1×KB中の「15」-sディップと交互に3サイクルによってプレコンディションAHCセンサ。 ロード：「200」秒間AHCセンサへのmAbサンプルをキャプチャします。 ベースライン：関連のステップの前に「60」sのBLI信号を確立します。 関連：「500」-s関連期間のヒトPCSK9の様々な濃度を含有するウェルにセンサを浸し。 解離：「1800」-s解離期間の1×KBの新しいウェルにPCSK9結合センサーを浸し。 再生：モノクローナル抗体-PCSK9坊を浸しndは各結合サイクルの間に2つの「18」-sパルスグリシン（pHは1.5）のウェルにセンサ。 「レビュー実験」では、手順をスライドさせて、前のタブに戻って行くことによって、必要に応じて変更を行います。 「ファイル名を指定して実行実験」では、「60」秒の遅延時間を入力し、待っている間にサンプルプレートを振ります。 Cキーを押し°プレート温度を「25」に設定し、「GO」を ForteBioのデータ解析ソフトウェアを使用したデータの分析 クリックして「データ選択|ロードされたデータ|動態| PCSK9抗体は、PCSK9 7.23.14への結合します」 「処理」では、プロセスデータは、次のように： ステップ1では：H1-H6でセンサーを強調するために、「センサ選択」をクリックし、右それらをクリックし、クリックして「変更センサータイプ|リファレンスセンサを。」 ステップ2では、「減算」をチェックして選択し、「平均基準センサー」; 6つのブランクの緩衝センサの平均値からの各アクティブサンプルセンサを減算します。 ステップ3で、「整列Y軸」をクリックして、関連する前のベースラインステップに全て結合曲線を整列させるために「ベースライン」を選択します。 ステップ5において、信号対雑音比を増加させることによって結合曲線を滑らかにし、クリックし、「のSavitsky-Golayのフィルタリングを」チェック「プロセスデータを！」。 ステップ6では、処理された結合曲線を表示するには、「処理結果」をクリックしてください。 ステップ7では、各処理工程の後に結合曲線を表示し、右側に4枚のパネルを確認し、「保存データの加工」をクリックします。 「分析」では、「会合および解離」をチェックして選択し、「1：1」モデルを。 「グローバル（フル）」「色」によってフィット感とグループにそれらをのための結合曲線を強調表示します。同じMで被覆されたセンサーに嵌合群を実行するように「連結さR maxを 」使用ABの濃度は、多数のmAb濃度でコーティングされたセンサーにグローバルフィッティングを実行するために実験的リガンド表面活性を計算するためのR max値 、及び「R maxのセンサによってリンク解除」を得ることができます。 装着動態パラメータを取得するために、「フィットカーブ」をクリックしてください。各フィッティング解析の終了時に結果を保存します。 IBIS MX96 5.動的測定 インストゥルメントおよび試薬の調製 室温で15分間COOH-Gチップを平衡化。 システムのランニングバッファ（PBS [pH7.4の]、0.01％のTween-20）および固定化緩衝液（10mM酢酸ナトリウム[pH5.0の]、0.01％のTween-20）の1-Lボトルを準備します。 緩衝液および酢酸ナトリウム（pH5.0）固定化バッファーを実行しているシステムの両方において2倍連続希釈することにより0.16μgの/ mLに20μgの/ mLの各mAbを調製します。 2 9月にのmAbサンプルを分配各mAbを、ウェル当たり200μLで滴定濃度で縦8つのウェルを占有するarate 96ウェルプレート。 室温で400mMのEDC及び100mMのスルホ-NHSのアリコートを解凍。 酢酸ナトリウム（pH5.0）固定化緩衝液中の50μg/ mLでプロテインA / Gの300μLを調製し、バイアルに、それをピペット。 バッファを実行しているシステムの2倍連続希釈することにより0.39 nmの100nm以上のヒトPCSK9の200μLを準備します。別々のバイアルにそれらをピペット。 アミン結合抗体アレイを有するマルチサイクル動態 EDC /スルホ-NHS（400ミリモル/ 100 mM）のアリコートを混合し、ウェル当たり200μLで新しい96ウェルプレートの上部48ウェルに混合物を分配します。 位置2におけるmAbソースプレート（酢酸ナトリウムで希釈した[pHは5.0]）とプリンタ内部の位置1におけるEDC /スルホ-NHS試薬プレートを置きます。 CFMにセンサチップをインストールします。 "CFM 2.0" softwarを開きますE、その後、「読み込み設定| 96アミンカップル」をクリックします。次のように10×8抗体アレイが作成されます。 「5」48分間マイクロチャネルを使用してセンサーに試薬プレートの上半分にEDC /スルホ-NHSを提供し、センサ表面上サイクルそれらを。 「10」分間活性化された表面を横切るセンサとサイクルそれらをソースプレートの上半分におけるmAbサンプルを届けます。 「5」分間抗体表面上に50 mLコニカルチューブから固定化バッファを提供します。 ソースプレートの下半分で、残りのmAbサンプルについて上記の手順を繰り返します。 機器に印刷されたセンサチップをドッキング。そして「2014年8月15日」を選択し「既存の測定|接続| |オープン計測ファイルを」制御ソフトウェアでは、クリックしてください。 「フルシステムスクリプト」の下に – 「全般」で、「システムプライムG」を選択します。そして、「Gを選択 – Quencを150μLの1Mエタノールアミンを注入したmAb表面を不活性化するための時間」。 モノクローナル抗体アレイを視覚化し、必要に応じてコントラストを調整する「カメラ」をクリックしてください。 mAbのスポットを囲むように赤い正方形のボックスを配置し、参照用の活性mAbのスポットの間に位置interspotsにある緑色の四角形ボックスを移動させます。 「IBISスクリプト」の下に – 「分析サイクル」では、「AP標準ランA」を選択します。ベースラインの1.0分間、関連10.0分、及び8μL/ sの速度で解離するための90個のステップを設定します。 「サイクル」の中で、5回のバッファ注射後の時間のヒトPCSK9 1つの濃度を注入。各結合サイクルの間にグリシンpHを2.0とのmAb表面を再生。 Fcを捕捉抗体アレイを有する単一サイクル動態 CFMに新たなセンサチップをインストールします。反復は、プロテインA / GでのmAbサンプルを置換することによって、上記5.2.5と5.2.3ステップ。 取り除きますMX96からセンサチップとCFMのプリンタにそれをバックに挿入します。 10分間の双方向フローを使用して48マイクロチャネルを用いてプロテインA / Gセンサ表面に板の上半分にモノクローナル抗体を提供し、表面を横切るサイクルそれらを。 プレートの下半分で、残りのmAbサンプルについて上記の手順を繰り返し。 MX96装置に印刷センサーチップをドッキング。データ集録ソフトウェアで、クリックして「ファイルを|接続|オープン計測|既存の測定|次」と「プロテインA + G結合kinetic7.30.14」を選択します。 モノクローナル抗体アレイを視覚化し、必要に応じてコントラストを調整する「カメラ」をクリックしてください。 mAbのスポットを囲むように赤い正方形のボックスを配置し、参照用の活性mAbのスポットの間に位置interspotsにある緑色の四角形ボックスを移動させます。 「IBISスクリプト」の下に – 「分析サイクル」では、「AP標準ランA」を選択します。 「ベースラインのための「1.0分」に設定します10.0「会合のため、および 『分8μL/秒の『速度10』で解離する工程』。 「サイクル」の中で、5回のバッファ注射後の時間のヒトPCSK9 1つの濃度を注入。何の再生は、各分析物注入の間に実行されません。 Sprintとスクラバーを使用したデータの分析 、|「オープントライアングルファイルファイルを」リスト内のすべてのサンプル注入を選択し、そして分析「をクリックする前に」「保存SprintXファイルを、」「キャリブレーション」、および「RLLの決意を確認し、」SprintXのsofwareで、クリックしてください。 注：RLL値は、センサー表面上に固定化された/捕捉されたmAbレベルを指します。 「参照」をチェックし、隣接参照スポットを使用するために、「ローカル」を選択します。また、最初の注射の「合わせ」をチェックし、クリックして「スタートオートメーションを。」 シリアル]タブでは、それらを調整する「ツールバーの表示ルーラー」を選択最初の試料注入の直前に、ベースラインの小領域を選択し、そして選択する「ゼロ」を 「ファイルをIBMXへエクスポート」を選択することで、スクラバーでの分析のための.IBMXファイルを生成し、クリックして「スタートオートメーションを。」 スクラバーを起動し、.IBMXファイルをロードします。 「希釈率」として、「株価の濃」と「2」と「100N」を入力します。 作物データは、注入の開始に先立って、すべてのベースラインを削除し、関連の開始時の結合曲線を整列させます。 注：シングル・サイクルの動力学実験のために、曲線を合わせていません。 、「動態」タブに移動し、射出終了時間のための定規を調整し、「K dを 」とフィットを選択し、「K dを固定します。」 「K dを K」と再びそれをフィット]を選択します。 K dの列をフロートし、さらにフィット感を調整するために再びフィット。 注：シングル・サイクル結合曲線のフィッティングのために、「OPTS」をクリックして選択を解除し、「引いて、」その後、「別」を選択し、バック理論的なベースラインの原点に関連プロファイルに合わせて、「インジェクションを開始」欄をフロート。 [結果]タブでフィット動態パラメータを確認します。