קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor
概要
אנו מתארים כאן פרוטוקולים לשקילה-אנטיגן הנוגדן מחייבת זיקת קינטיקה באמצעות פלטפורמות biosensor ארבע נפוצות.
Abstract
לייבל ללא חיישנים אופטיים הם כלים רבי עוצמה גילוי סמים לאפיון של אינטראקציות biomolecular. במחקר זה, אנו מתארים את השימוש ארבע פלטפורמות biosensor בשימוש שיגרתי במעבדה שלנו להעריך את הזיקה ואת קינטיקה המחייבות של עשרה נוגדנים חד שבטיים בעלי אפיניות (מבז) נגד סוג Kexin סבטיליזין convertase האנושי proprotein 9 (PCSK9). בעוד הן Biacore T100 ו ProteOn XPR36 נגזרים תהודת Plasmon Surface והמבוססת (SPR) טכנולוגיה, יש לשעבר ארבעה תאי זרימה המחוברים באמצעות תצורת זרימת סדרתי, ואילו המתנות האחרונות 36 נקודות תגובה במקביל באמצעות שתי וערב מאולתר 6 x 6 תצורת ערוץ microfluidic. איביס MX96 גם פועל על בסיס טכנולוגיית חיישן SPR, עם תכונת הדמיה נוספת המספקת איתור באורינטציה המרחבית. טכניקה לגילוי זה בשילוב עם Microspotter הזרימה הרציף (CFM) מרחיבה את התפוקה באופן משמעותית על ידי דוארnabling הדפסת מערך מולטיפלקס וזיהוי של 96 ספורט תגובה זמנית. לעומת זאת, אוקטט RED384 מבוסס על Interferometry BioLayer (BLI) העיקרון אופטי, עם בדיקות סיבים אופטיים מתנהגות כמו biosensor לזהות תבנית התאבכות משנה על מחייב אינטראקציות על פני שטח הקצה. בניגוד פלטפורמות מבוססות SPR, מערכת BLI אינו מסתמך על fluidics זרימה רציפה; במקום, עצות החיישן לאסוף קריאות בזמן שהם שקועים פתרונות אנליטי של microplate 384-היטב במהלך תסיסה מסלולית.
כל אחד פלטפורמות biosensor הללו יש יתרונות וחסרונות משלה. כדי לספק השוואה ישירה של היכולת המכשירים הללו כדי לספק נתונים הקינטית איכות, בפרוטוקולים המתוארים להמחיש ניסויים להשתמש באותו פורמט assay ואת ריאגנטים איכותיים באותו לאפיין קינטיקה-אנטיגן נוגדן שמתאים 1 הפשוט: מודל האינטראקציה המולקולרי 1 .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
ראש-בראש מחקר ההשוואה שלנו מראה כי כל אחת מפלטפורמות biosensor יש עוצמות וחולשות משלו. למרות הפרופילים המחייבים של הנוגדנים דומים ידי השוואה ויזואלית (איורים 3 – 6), ואת סדר הדירוג של קבועי קצב הקינטית רכש הם מאוד עקביים המכשירים (איור 7), התוצאות שלנו מראות כי SPR מבוססים מכשירים עם fluidics זרימה הרציף) טוב יותר בפתרון אינטראקציות זיקה גבוהה עם שיעורי ניתוק איטיים. להיסחף כלפי מעלה במהלך שלב הניתוק הוא ציין מערכי נתונים (למשל, מב 2, מב 5, ו מב 9; איור 5) שנוצר על ידי מכשיר fluidics ללא BLI. ממצא זה ניתן לייחס במידה רבה אידוי מדגם לאורך זמן microplate, שהינה מגבלה עיקרית של המערכת. עם ההגבלה הטבועה הזו, בפעם ניסיון גם מוגבלת פחות מ 12 h; ולכן הניסויים תוכנתו עם shפעמי orter (עמותה של 500 ו 30 ניתוק דקות) בהשוואה לאלו של פלטפורמות האחרות (עמותת 10 דקות ו 45 ניתוק דקות). עם זאת, קיצור זמן הניסוי לא הופיע כדי להקטין את ההשפעה של אידוי על נתוני איכות / עקביות, כמו קבועי קצב שנוצר על ידי מכשיר המבוסס BLI להראות פחות ליניאריות כתוצאה מתנודות חלק מחוץ שיעורי (איור 8C ). בנוסף אידוי מדגם, ההבדלים ריאגנטים הלכיד בשימוש אולי תרמו גם להבדלים בתוצאות שהתקבלו. בעוד חלבון A / G שמש בכל שלוש פלטפורמות SPR מבוסס fluidics, חיישני AHC שמשו פלטפורמת BLI הלא fluidics. מאז חלבון A / G הוא עלול להיות בעל זיקה חלשה עבור מהבז מ עושה AHC, משטח biosensor מבוסס נוגדנים, אשראי החוץ-השיעורים במתחם מב-אנטיגן מן משטחי החלבון A / G עשויה להופיע מהר מלאכותית מאלה המתקבל משטח AHC. אפשרות זו נתמכת בy נתוני הניסוי מראים כי הערכים מחוץ השיעור שנוצרו על ידי פלטפורמת BLI היו נמוכים באופן עקבי מאלה המתקבלים מכשירים האחרים (איור 7, קו אדום). אף על פי כן, הפלטפורמה BLI יש יתרונות שונים על פני פלטפורמות אחרות. לדוגמא, הוא גמיש מאוד לגבי בחירת חיישן ותצורת assay בשל החיישנים טרום מצופה השונים לשימוש מיידי. בניסויים שלנו, שימוש בחיישני AHC בטל את הצורך בצעדים וקיבוע ליגנד, צמצום זמן ההכנה. יתר על כן, פלטפורמת BLI דורשת הרבה פחות תחזוקה לעומת פלטפורמות SPR fluidics האחרות, הכוללות תצורות מתג צינורות וערך מסובכות. תכונה זו מהווה יתרון עבור ניסויים הכוללים דגימות גולמיות שיכול לגרום לבעיות סתימה וזיהום.
ככל שהביקוש זיהוי יעיל, מהיר, מדויק של עליות מועמדים טיפולית, את הצורך דותפוקת osensor גם עולה. בין ארבע פלטפורמות biosensor, התפוקה מן biosensor מסוגל 96-ליגנד הדפסת מערך הוא הגבוה ביותר, ואחריו biosensor מצמיד לתבנית 36-ליגנד מזגזגי biosensor המבוסס BLI עם הודעה סימולטני ערוץ 16, אשר בסופו של דבר להגדיל מספר האינטראקציות נמדדו מחזור מחייב יחיד 96, 36 ו 16, בהתאמה. ותפוקה אלה גבוהות משמעותיים מזה של פלטפורמת SPR המסורתית, אשר מוגבלת על ידי בעל תאי זרימה ארבע בלבד מחוברים באמצעות זרימת סדרה יחידה. מאז הניסויים שלנו מעורב סט מדגם קטן יחסית של 10 מבזים העריכו בצפיפויות משטח מרובות עם פעמי ניתוק ארוכות, throughputs אינסטרומנטלי שחק תפקיד מתון בקביעת היעילות של הניסויים. לא היו הבדלים משמעותיים פעמים הניסיוניות של השלוש פלטפורמות תפוקה גבוהה, ובכל מקרי הניסויים הושלמו ביום אחד. מצד השני, ניסויי SPR זרימת סדרתי המסורתיים נדרשים 3 ימים כדי להשלים, למרות אוטומצית הליכה משם רכישת נתונים לאחר התקנה. במחקרים אחרים הכרוכים מספר רב של דגימות (כלומר במאות או אלפי), עבור בדירוג מחוץ שיעור / הקינטית למטרות הקרנה או אפיטופ binning, התפוקה הופכת לגורם קריטי.
למרות התפוקה ב MX96 IBIS היא סדר הגודל גבוהה יותר מזה של החיישנים הביולוגיים האחרים ולכן הוא בחירה אופטימלית עבור מטרות אלה, יש לו כמה חסרונות. בפרט, הדפסת המערך ידי CFM מציגה סתירות משטח גדולות (איור 1) ואת שחזור נתונים מופחת (איור 8D ו 8E). עבור מדידות הקינטית מדויקות, בסכום של ליגנד על פני שטח biosensor הוא פרמטר קריטי כי צריך להיות מבוקרים על מנת להבטיח כי התגובות המחייבות אינן מוטרדות גורמים משניים כגוןהעברה או הפרעה סטרית המונית. עבור Biacore T100 ו ProteOn XPR36, רמות L R האופטימלי נקבעו בהתבסס על חישוב התקן של ערכי מקסימום R הסט כמתואר במאמר המחקר 17. מצד שני, עבור פלטפורמות אוקטט RED384 ו IBIS MX96, רמות ללכוד מב הושגו באופן אמפירי באמצעות סדרה של 2 פי בדילול נוגדנים סדרתי בזמנים קבועים. חוסר ידע או שליטה של הצעד ללכוד הביא משטח בצפיפות גבוהה אותות תגובה מחייבים גבוהים (איור 2) שאולי נפגעת הדיוק של קבועי קצב הקינטית. יתר על כן, ההפרדה של המדפסת ממגלה SPR אתגר גם בעת ביצוע מדידות מחזור מחייב מספר מעורבים regenerations. הדרך היחידה לבצע את התקנת קינטיקה רב מחזור הייתה דרך צימוד אמין ישיר של מבז, להבדיל ללכוד דרך Fc מב ידי חלבון המשותק / Gשטח של פלטפורמות biosensor השלוש אחרים. כתוצאה מכך, ניסוי צופיות התחדשות נוסף נדרש לקבוע את תנאי התחדשות האופטימליים. התוצאה של התקנה זו נמצאה קשורה% ~ 90 פעילות שטח נצפה נמוכות לעומת השיטה ללכוד FC (איור 9), בנוסף לזמן הניסיון כבר. כדי לבצע את השיטה ללכוד FC, גישה הקינטית חלופה חד מחזור אומץ. גישה זו כוללת הזרקה הרציפה של אנליטי להגדיל ריכוזים ללא התחדשות בין כל הזרקה (איור 2). גישה נוחה מאוד זה, אבל פחות מיושם בדרך כלל לא רק קיצרו את זמן הניסוי והפחתה של צריכת מגיב, אלא גם הפיק קבועי קצב הקינטית מאוד דומים לאלה של חיישנים ביולוגיים אחרים (איור 7). לכן, החלת גישת קינטיקה חד מחזור זה מתגבר על מגבלת התצורה גלומה במכשיר ומציגהזדמנות להשגת קבועי קצב הקינטית ברזולוציה גבוהה באופן תפוקה גבוהה.
למרות התפוקה להיות מגבלה עיקרית של Biacore T100, התוצאות שלנו קולקטיביות להראות כי היא הצמיחה את הנתונים העקביים ביותר עם האיכות הגבוהה ביותר. זה היה ואחריו ProteOn XPR36, אשר יש ~ 10 של פי תפוקה גבוהה יותר. יכולתי ליצור נתונים איכותיים הופך יתרון כאשר מאפיינים אינטראקציות גבוהה זיקה-אנטיגן נוגדן שיכול להיות מאתגר מבחינה טכנית כאשר מגבלות זיהוי המכשירים הם הגיעו. בעוד המגבלות השיטתיות מכשור של RED384 אוקטט לעכב מדידה המדויקת של קבועי קצב דיסוציאציה (כלומר, נפילה קצרה של הרגישות לפתור ריקבון אות מספיק איטי מחוץ שיעורים), הן Biacore T100 ו ProteOn XPR36 יכול לספק רגישות ואמינה איתור לבידול.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים נח כנ"ל ואדם מיילס לקבלת סיוע טכני על MX96 IBIS.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
参考文献
- Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
