Détermination de l'anticorps-antigène à haute affinité de liaison Kinetics En utilisant quatre plates-formes biocapteurs
概要
Nous décrivons ici les protocoles pour la mesure de l'affinité de liaison anticorps-antigène et la cinétique en utilisant quatre plates-formes de biocapteurs couramment utilisés.
Abstract
biocapteurs optiques sans étiquette sont des outils puissants dans la découverte de médicaments pour la caractérisation des interactions biomoléculaires. Dans cette étude, nous décrivons l'utilisation de quatre plates-formes de biocapteurs utilisées régulièrement dans notre laboratoire pour évaluer l'affinité de liaison et la cinétique de dix anticorps monoclonaux de haute affinité (mAb) contre la pro-protéine convertase subtilisine humaine kexine type 9 (PCSK9). Bien que les deux Biacore T100 et ProteOn XPR36 sont dérivées de la technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) bien établie, le premier a quatre cellules d'écoulement connectés selon la configuration d'écoulement en série, tandis que le second présente 36 taches de réaction en parallèle à travers une improvisée 6 x 6 entrecroisé configuration microfluidique du canal. Le IBIS MX96 exploite également basé sur la technologie de capteur SPR, avec un dispositif d'imagerie supplémentaire qui permet la détection de l'orientation spatiale. Cette technique de détection associée à l'écoulement continu Microspotter (CFM) augmente le débit de manière significative par enabling impression de réseau multiplex et la détection de 96 sports de réaction simultanément. En revanche, le RED384 Octet est basé sur le principe optique biocouche interférométrie (BLI), avec des sondes à fibre optique agissant en tant que biocapteur pour détecter motif d'interférence change sur des interactions de liaison à la surface de pointe. Contrairement aux plates-formes SPR, le système de BLI ne repose pas sur fluidiques de flux continu; à la place, les conseils de capteurs recueillent des lectures alors qu'ils sont plongés dans des solutions d'analyte d'une microplaque 384 puits pendant l'agitation orbitale.
Chacune de ces plates-formes de biocapteurs a ses propres avantages et inconvénients. Pour fournir une comparaison directe de la capacité de ces instruments de fournir des données cinétiques qualité, les protocoles décrits illustrent des expériences qui utilisent le même format d'essai et les mêmes réactifs de haute qualité pour caractériser la cinétique anticorps-antigène qui correspondent à la 1 simple: 1 modèle d'interaction moléculaire .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre étude comparative en tête-à-tête montre que chaque plate-forme de biocapteur a ses propres forces et faiblesses. Même si les profils de liaison des anticorps sont similaires par comparaison visuelle (figures 3 – 6), et l'ordre de rang des constantes cinétiques acquises sont très cohérentes à travers les instruments (figure 7), nos résultats montrent que les instruments fondés sur SPR avec fluidique à écoulement continu) sont mieux à la résolution des interactions de haute affinité avec les vitesses de dissociation lente. La dérive vers le haut pendant la phase de dissociation est observée dans les groupes de données (par exemple, 2 mAb, mAb 5, et mAb 9; Figure 5) généré par l'instrument libres fluidique-BLI. Cette constatation peut être attribuée en grande partie à l'évaporation de l'échantillon au fil du temps dans la microplaque, ce qui est une première limite du système. Avec cette limitation inhérente, le temps expérimental est également limitée à moins de 12 h; les expériences ont donc été programmées avec shOrter fois (500 de l'association et de dissociation 30 min) par rapport à celles des autres plates-formes (association de 10 min et 45 min de dissociation). Cependant, ce qui réduit le temps expérimental ne semble pas atténuer l'impact de l' évaporation sur la qualité / la cohérence des données, les constantes de vitesse générées par l'instrument à base de BLI montrent moins la linéarité en raison des fluctuations de certains des hors-taux (figure 8C ). En plus de l'évaporation de l'échantillon, les différences dans les réactifs de capture utilisés peuvent aussi avoir contribué aux différences dans les résultats obtenus. Alors que la protéine A / G a été utilisé dans les trois plates-formes à base fluidiques-SPR, capteurs AHC ont été utilisés dans la plate-forme de BLI non-fluidiques. Étant donné que la protéine A / G est susceptible d'avoir une affinité plus faible pour les mAbs que ne l'AHC, une surface de biocapteur à base d'anticorps, les hors-taux du complexe antigène-anticorps monoclonal à partir des surfaces de protéine A / G peut apparaître artificiellement plus rapidement que celles obtenu à partir de la surface AHC. Cette possibilité est prise en charge by les données expérimentales montrent que les valeurs de taux générés par la plate – forme BLI étaient toujours inférieures à celles obtenues à partir des autres instruments (Figure 7, ligne rouge). Néanmoins, la plate-forme de BLI a des avantages sur les autres plates-formes. Par exemple, il est très flexible en ce qui concerne le choix du capteur et la configuration d'essai en raison des différents capteurs pré-enduit pour une utilisation immédiate. Dans nos expériences, l'utilisation des capteurs AHC a éliminé la nécessité pour les étapes d'immobilisation du ligand, ce qui réduit le temps de préparation. En outre, la plate-forme de BLI nécessite beaucoup moins d'entretien par rapport aux autres plates-formes fluidiques de Spr, qui comportent des tubes et des configurations commutateur de valeur complexe. Cette caractéristique est un avantage pour les expériences sur des échantillons bruts qui peuvent causer des problèmes de colmatage et de contamination.
Comme la demande pour l'identification efficace, rapide et précise des candidats thérapeutiques augmente, la nécessité de bile débit de osensor augmente également. Parmi les quatre plateformes de biocapteurs, le débit du biocapteur capable d'imprimer de réseau de 96 ligand est le plus élevé, suivi par le biocapteur couplé à un entrecroisement le format 36-ligand et le biocapteur à base de BLI avec affichage simultané de 16 canaux, ce qui augmente finalement le nombre d'interactions mesurées en un seul cycle de liaison 96, 36 et 16, respectivement. Ces capacités de débit sont nettement supérieure à celle de la plate-forme traditionnelle SPR, qui est limitée par ne comportant que quatre cellules d'écoulement reliées par un seul flux série. Étant donné que nos expériences impliquaient un ensemble d'échantillons relativement faible de 10 anticorps monoclonaux évalués à des densités de surface multiples avec de longs temps de dissociation, les instrumentaux ont joué un débits rôle modéré dans la détermination de l'efficacité des expériences. Il n'y avait pas de différence significative dans les temps expérimentaux des trois plates-formes à haut débit, et dans tous les cas, les expériences ont été réalisées en un jour. D'autre part, les expériences traditionnelles de flux SPR série requis 3 jours pour compléter, en dépit de l'automatisation des rendez-vous loin de l'acquisition de données après l'installation. Dans d' autres études qui impliquent un grand nombre d'échantillons (dans les centaines ou des milliers), à des fins de classement hors taux / dépistage cinétique ou épitope binning, le débit devient un facteur critique.
Bien que le débit de l'hôtel Ibis MX96 est des ordres de grandeur supérieure à celle des autres biocapteurs et est donc un choix optimal à ces fins, il a quelques défauts. En particulier, l'impression de la matrice par le CFM montre de grandes incohérences de surface (figure 1) et de reproductibilité des données réduite (Figure 8D et 8E). Pour les mesures cinétiques précises, la quantité de ligand sur la surface de biocapteur est un paramètre critique qui doit être contrôlé pour faire en sorte que les réponses de liaison ne sont pas perturbés par des facteurs secondaires tels quetransfert de masse ou un encombrement stérique. Pour le T100 Biacore et ProteOn XPR36, les niveaux optimaux de R L ont été déterminées sur la base du calcul standard de série R valeurs max tel que décrit dans l'article de recherche 17. D'autre part, pour les Octet RED384 et les plates-formes IBIS MX96, les niveaux de capture de mAb ont été obtenus de manière empirique en utilisant une série de 2 fois en série d'anticorps dilué à des moments constants. Le manque de connaissance ou de contrôle de l'étape de capture a entraîné une surface à haute densité et haute des signaux de réponse de liaison (figure 2) qui peut avoir compromis l'exactitude des constantes de vitesse cinétique. En outre, la séparation de l'imprimante à partir du détecteur présente également un SPR défi lors de la réalisation de multiples mesures du cycle de liaison impliquant régénérations. La seule façon de procéder à la configuration de la cinétique multi-cycle est par couplage d'aminé directe des mAbs, par opposition à saisir par l'intermédiaire du mAb Fc par la protéine A immobilisée / Gsurface dans les trois autres plateformes de biocapteurs. En conséquence, une expérience supplémentaire de reconnaissance de la régénération a été nécessaire pour déterminer les conditions optimales de régénération. Le résultat de cette configuration est liée à une ~ 90% de l' activité observée surface inférieure par rapport à la méthode de capture Fc (figure 9), en plus d'un temps plus long expérimental. Pour exécuter la méthode de capture Fc, une approche cinétique unique cycle alternatif a été adopté. Cette approche implique l'injection séquentielle de l' analyte à des concentrations croissantes sans régénération entre chaque injection (Figure 2). Cette très pratique, mais approche moins souvent appliquée raccourci non seulement le temps expérimental et réduit la consommation de réactif, mais aussi produit des constantes cinétiques très similaires à celles des autres biocapteurs (figure 7). Par conséquent, l'application de cette approche cinétique unique du cycle surmonte la limitation de configuration inhérente de l'instrument et présente unepossibilité d'obtenir des constantes de vitesse cinétique à haute résolution d'une manière à haut débit.
Malgré le débit étant une limitation majeure dans le Biacore T100, nos résultats montrent collectivement qu'il a généré les données les plus compatibles avec la plus haute qualité. Cela a été suivi par le ProteOn XPR36, qui a ~ 10 fois un débit plus élevé. Leur capacité à générer des données de haute qualité devient un avantage lors de la caractérisation des interactions anticorps-antigène à haute affinité qui peuvent être techniquement difficile lorsque les limites de détection des instruments sont atteints. Bien que les limites systématiques dans l' instrumentation de l'Octuor RED384 empêchent la mesure précise des constantes de vitesse de dissociation (c. -à- deçà de la sensibilité pour résoudre la décomposition du signal suffisant pour lent hors taux), aussi bien le Biacore T100 et ProteOn XPR36 peut fournir sensible et fiable la détection de la différenciation.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Noah Ditto et Adam Miles d'assistance technique sur le IBIS MX96.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
参考文献
- Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
