Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms
概要
We beschrijven hier protocollen voor het meten van antilichaam-antigeen-bindende affiniteit en kinetiek met vier gebruikelijke biosensor platforms.
Abstract
Label-vrije optische biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen in drug discovery voor de karakterisering van biomoleculaire interacties. In deze studie beschrijven we het gebruik van vier routinematig biosensor platforms in ons laboratorium om de bindingsaffiniteit en kinetiek van tien hoge affiniteit monoklonale antilichamen (mAbs) tegen humaan subtilisine proprotein convertase Kexin Type 9 (PCSK9) te evalueren. Terwijl zowel Biacore T100 en Proteon XPR36 zijn afgeleid van de gevestigde Surface Plasmon Resonance (SPR) technologie, de eerstgenoemde vier stroomcellen verbonden door seriële stroom configuratie, terwijl laatstgenoemde stelt 36 reactiemengsel spots in parallel via een geïmproviseerde 6 x 6 kruiselings microfluïdische kanaalconfiguratie. IBIS MX96 werkt ook op basis van de SPR sensortechnologie, met een extra imaging functie die detectie bepaalt ruimtelijke oriëntatie. Deze detectietechniek combinatie met de continue toediening Microspotter (CFM) breidt de doorvoersnelheid pernabling multiplex matrix printen en detectie van 96 reactie sport tegelijkertijd. Daarentegen wordt het Octet RED384 basis van de BioLayer interferometrie (BLI) optisch principe met optische probes als de biosensor aan interferentiepatroon detecteren verandert na binding interacties op het tipoppervlak. In tegenstelling tot de SPR-gebaseerde platforms, heeft de BLI-systeem niet vertrouwen op continue stroom fluidics; in plaats daarvan de sensor tips verzamelen metingen terwijl ze in analytoplossingen van een 384-putjes microplaat worden ondergedompeld tijdens orbitaal roeren.
Elk van deze biosensor platforms heeft zijn eigen voor- en nadelen. 1 moleculair interactiemodel: een directe vergelijking van het vermogen van deze instrumenten om kwaliteit kinetische gegevens, de beschreven protocollen illustreren experimenten die dezelfde test formaat en dezelfde hoge kwaliteit reagens om antilichaam-antigen kinetiek die de simpele 1 stop karakteriseren bieden .
Introduction
The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the “gold standard” for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7.
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96’s SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an “all-in-one” setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate “dip-and-read” use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument’s fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a “one-shot” kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle.
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, “Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics”17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze head-to-head vergelijking studie toont aan dat elke biosensor platform heeft zijn eigen sterke en zwakke punten. Hoewel de bindingsprofielen van de antilichamen vergelijkbaar door visuele vergelijking (figuren 3-6), en de rangorde van de verkregen kinetische snelheidsconstanten zeer consistent instrumenten (figuur 7), onze resultaten tonen aan dat SPR gebaseerde instrumenten continue stroom vloeistofcomponenten) zijn beter in oplossing met hoge affiniteit interacties met trage dissociatie tarieven. Toenemend verschil in de dissociatiefase waargenomen in datasets (bijvoorbeeld mAb 2, 5 mAb, mAb en 9 Figuur 5) gegenereerd door de BLI fluidics-vrij instrument. Deze bevinding kan grotendeels toegeschreven monster verdamping tijd in de microtiterplaat en een belangrijkste beperking van het systeem. Deze inherente beperking, worden experimentele keer ook beperkt tot minder dan 12 h; de experimenten werden daarom geprogrammeerd met shorter keer (500 s associatie- en dissociatie 30 min) vergeleken met die van andere platformen (10 min associatie- en dissociatie 45 min). Echter, het verkorten van de experimentele tijd niet lijken om de impact van de verdamping op de kwaliteit van de gegevens / consistentie te beperken, als de snelheid constanten die door de BLI-gebaseerde instrument tonen minder lineariteit als gevolg van fluctuaties in een aantal van de off-rates (Figuur 8C ). Naast monster verdamping, kunnen afwijkingen in de invangreagentia die hebben bijgedragen tot de verschillen in de resultaten. Terwijl proteïne A / G werd in alle drie fluidics SPR gebaseerde platforms werden AHC sensoren voor non-fluidics BLI platform. Omdat proteïne A / G zal waarschijnlijk een zwakkere affiniteit voor de mAbs dan doet de AHC, een antilichaam gebaseerde biosensor oppervlak, de off-rates van de mAb-antigeencomplex van het proteïne A / G oppervlakken kan kunstmatig lijkt sneller dan hebben verkregen uit het AHC oppervlak. Deze mogelijkheid wordt ondersteund by de experimentele gegevens die aantonen dat de off-rate waarden gegenereerd door de BLI platform constant lager dan die verkregen uit andere instrumenten (figuur 7, rode lijn). Toch is de BLI platform heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere platformen. Zo is het zeer flexibel in sensor keuze en proefconfiguratie gevolg van de verschillende vooraf beklede sensoren voor onmiddellijk gebruik. In onze experimenten, het gebruik van de AHC sensoren langer nodig dat de ligand immobilisatie stappen, waardoor de voorbereidingstijd. Bovendien is de BLI platform vergt minder onderhoud vergeleken met de andere vloeistofcomponenten SPR platforms, die ingewikkeld slangen en waar switchconfiguraties voorzien. Dit kenmerk is een voordeel voor experimenten met ongezuiverde monsters die verstopping en vervuiling problemen kunnen veroorzaken.
Omdat de vraag voor een efficiënte, snelle en nauwkeurige identificatie van therapeutische kandidaten toeneemt, neemt de behoefte aan biosensor throughput stijgt eveneens. Van de vier biosensor platforms, het debiet van de biosensor geschikt 96-ligand matrix printen is het hoogst, gevolgd door de biosensor gekoppeld met een kriskras 36-ligand formaat en het BLI-gebaseerde biosensor met 16-kanaals gelijktijdige uitlezing, wat uiteindelijk stijgen het aantal interacties gemeten in een bindcyclus 96, 36 en 16, respectievelijk. Deze throughput mogelijkheden zijn significant hoger dan die van de traditionele SPR platform, dat wordt begrensd doordat slechts vier stroomcellen verbonden door een seriële stroom. Aangezien onze experimenten betrof een relatief kleine steekproef stel 10 mAbs geëvalueerd op verschillende oppervlaktedichtheden met lange dissociatie maal de instrumentele doorvoer speelde matige rol bij het bepalen van de efficiëntie van de experimenten. Er waren geen significante verschillen in de experimentele tijden van de drie high-throughput platformen, en in alle gevallen werden de experimenten in één dag voltooid. Aan de andere kant, de traditionele seriële stroom SPR experimenten vereist 3 dagen in beslag, ondanks de walk-away automatisering van data-acquisitie na de installatie. In andere studies die een groot aantal monsters (dat wil zeggen in de honderden of duizenden) omvatten, voor off-rate ranking / kinetische screening of epitoop binning doeleinden, het debiet wordt een kritische factor.
Hoewel de consumptie in IBIS MX96 is orden van grootte hoger dan die van de andere biosensoren en daarom een optimale keuze voor deze doeleinden heeft enkele tekortkomingen. Met name de matrix drukken van de CFM toont groot oppervlak inconsistenties (figuur 1) en gereduceerde data reproduceerbaarheid (Figuur 8D jp 8E). Voor nauwkeurige kinetische metingen de hoeveelheid ligand op de biosensor oppervlak een kritische parameter die moet worden geregeld zodanig dat de binding responsen niet worden verstoord door secundaire factoren zoalsmassaoverdracht of sterische hindering. Voor de Biacore T100 en Proteon XPR36 werden de optimale RL niveaus bepaald op basis van de standaardberekening van ingestelde Rmax waarden zoals beschreven in het onderzoek artikel 17. Anderzijds, voor Octet RED384 en IBIS MX96 platforms, het mAb capture niveaus werden bereikt empirisch met behulp van een reeks 2-voudig serieel verdunde antilichamen met constante tijd. Het gebrek aan kennis of controle van de vangstap resulteerde in een hoge dichtheid oppervlak en hoge binding responssignalen (figuur 2) dat de nauwkeurigheid van de kinetische snelheidsconstanten gevaar zouden brengen. Bovendien is de scheiding van de printer in de SPR detector presenteert ook een uitdaging bij het uitvoeren van meerdere metingen bindcyclus met regeneraties. De enige manier om de multi-cycle kinetiek instelling uit te voeren is door directe koppeling van het amine mAb, in tegenstelling tot het mAb Fc te vangen door het geïmmobiliseerde proteïne A / Goppervlak in de andere drie biosensor platforms. Als resultaat werd een extra regeneratie verkennende experimenten nodig om de optimale condities te bepalen regeneratie. Het resultaat van deze opstelling is verbonden met een -90% lager waargenomen oppervlakteactiviteit vergeleken met de Fc invangwerkwijze (figuur 9), naast een experimentele langere tijd. Om de Fc capture methode uit te voeren, werd een alternatief single-cycle kinetische benadering. Deze benadering omvat de achtereenvolgende injectie van analyt toenemende concentraties zonder regeneratie tussen elke injectie (figuur 2). Dit zeer gunstig, maar minder algemeen toegepaste benadering niet alleen verkort de experimentele tijd en verminderde reagensverbruik, maar produceerde ook kinetische snelheidsconstanten vrijwel gelijkwaardig aan die van de andere biosensoren (figuur 7). Daarom deze enkele cyclus kinetiek benadering overwint de inherente beperking configuratie van het instrument en fungeertmogelijkheid tot het verkrijgen van hoge-resolutie kinetische snelheidsconstanten in een high-throughput manier.
Ondanks de doorvoer dat een belangrijke beperking in de Biacore T100, onze resultaten laten zien collectief dat het genereren van de meest consistente gegevens met de hoogste kwaliteit. Dit werd gevolgd door de Proteon XPR36 die ~ 10-voudig hogere doorvoer heeft. Hun vermogen om hoge kwaliteit te genereren wordt een voordeel bij het karakteriseren hoge affiniteit antilichaam-antigen interacties die technisch uitdagend zijn wanneer detectielimiet van het instrument bereikt. En de systematische beperkingen in instrumentatie van de Octet RED384 belemmeren de nauwkeurige meting van dissociatiesnelheidsconstanten (dat wil zeggen, achter bij de gevoeligheid voldoende verval van het signaal voor langzame off-rates te lossen), zowel de Biacore T100 en Proteon XPR36 kunnen gevoelig en betrouwbaar is detectie voor differentiatie.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Noah Ditto en Adam Miles voor technische bijstand aan de IBIS MX96.
Materials
| Biacore T100 System | GE Healthcare | 28975001 | The T100 system has been upgraded to T200 |
| CM5 Sensor Chip | GE Healthcare | BR100012 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | Version 4.1 | |
| Biacore T100 Control Software | GE Healthcare | The T100 control software has been upgraded to T200 | |
| Amine Coupling Kit | GE Healthcare | BR100050 | It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5 |
| HBS-EP+ Buffer 10× | GE Healthcare | BR100669 | Concentrated stock solution |
| Plastic Vials, o.d. 7 mm | GE Healthcare | BR100212 | |
| Rubber Caps, type 3 | GE Healthcare | BR100502 | |
| Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm | GE Healthcare | BR100214 | |
| ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System | Bio-Rad | 1760100 | |
| ProteOn Manager Software | Bio-Rad | 1760200 | Version 3.1.0.6 |
| GLM Sensor Chip | Bio-Rad | 1765012 | |
| Amine Coupling Kit | Bio-Rad | 1762410 | It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl |
| Regeneration and Conditioning Kit and Buffers | Bio-Rad | 1762210 | It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution |
| 2 L PBS/Tween/EDTA buffer | Bio-Rad | 1762730 | It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA |
| Octet RED384 System | FortéBio | ||
| Data Analysis Software | FortéBio | Version 9.0.0.4 | |
| Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors | FortéBio | 18-5060 | One tray of 96 biosensors |
| 384-Well Tilted-Bottom Plate | FortéBio | 18-5080 | |
| Biosensor Dispenser | FortéBio | 18-5016 | |
| Kinetics Buffer 10X | FortéBio | 18-1092 | 10X concentration. Contains ProClin 300. |
| IBIS MX96 SPRi System | Wasatch Microfluidics | ||
| Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer | Wasatch Microfluidics | Version 2.0 | |
| SensEye COOH-G chip | Wasatch Microfluidics | 1-09-04-004 | |
| Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.19.3.17 | |
| SPRint Data Analysis Software | Wasatch Microfluidics | Version 6.15.2.1 | |
| Scrubber 2 | BioLogic Software | Version 2 | |
| Pierce Recombinant Protein A/G | ThermoFisher Scientific | 21186 |
参考文献
- Cooper, M. A. Optical biosensors in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).
- Van Regenmortel, M. H., et al. Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors. J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).
- Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore. Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).
- Katsamba, P. S., et al. Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users. Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).
- Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).
- Abdiche, Y. N., et al. High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity. PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
- Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).
- Lad, L., et al. High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry. J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).
- Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions. Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).
- Eddings, M. A., et al. Improved continuous-flow print head for micro-array deposition. Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet. Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
- Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis. Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).
- Rich, R. L., et al. A global benchmark study using affinity-based biosensors. Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms. Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).
- Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC. Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).
