概要

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em> Xenopus tropicalis</em

Published: May 25, 2017
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概要

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Abstract

Blutgefäße liefern Sauerstoff und Nährstoffe im ganzen Körper, und die Bildung des Gefäßnetzes ist unter engen Entwicklungskontrolle. Die effiziente In-vivo- Visualisierung von Blutgefäßen und die zuverlässige Quantifizierung ihrer Komplexität sind der Schlüssel zum Verständnis der Biologie und der Erkrankung des Gefäßnetzes. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Verfügung, um Blutgefäße mit einem handelsüblichen Fluoreszenzfarbstoff, einem humanen Plasma acetylierten Diiplex (DiI-AcLDL) mit niedriger Dichte zu identifizieren und ihre Komplexität in Xenopus tropicalis zu quantifizieren . Blutgefäße können durch eine einfache Injektion von DiI-AcLDL in das schlagende Herz eines Embryos markiert werden, und Blutgefäße im gesamten Embryo können in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden. Kombiniert mit der Genstörung durch die gezielte Mikroinjektion von Nukleinsäuren und / oder die Badanwendung von pharmakologischen Reagenzien können die Rollen eines Gens oder eines Signalweges auf der Gefäßentwicklung auftretenStammte innerhalb einer Woche ohne Rückgriff auf anspruchsvolle gentechnisch veränderte Tiere. Wegen des wohldefinierten venösen Systems von Xenopus und seiner stereotypen Angiogenese kann das Keimen von bereits vorhandenen Gefäßen die Gefäßkomplexität nach Störungsexperimenten effizient quantifiziert werden. Dieses relativ einfache Protokoll sollte als ein leicht zugängliches Werkzeug in verschiedenen Bereichen der Herz-Kreislauf-Forschung dienen.

Introduction

Die Vaskulogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus neugeborenen Endothelzellen und die Angiogenese, die Bildung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Gefäßen, sind zwei verschiedene Prozesse, die das embryonale Gefäßbild verändern. Jede Dysregulation in diesen Prozessen führt zu verschiedenen Herzerkrankungen und strukturellen Anomalien der Gefäße. Darüber hinaus ist das Tumorwachstum mit dem unkontrollierten Gefäßwachstum verbunden. Als solche sind molekulare Mechanismen, die der Vaskulogenese und der Angiogenese zugrunde liegen, Gegenstand intensiver Untersuchungen 2 .

Xenopus und Zebrafisch sind aus verschiedenen Gründen attraktive Wirbeltiermodelle für Vaskulogenese- und Angiogenese-Studien. Zuerst sind ihre Embryos klein; Daher ist es relativ einfach, die gesamte vaskulatur zu bildlich zu machen. Zweitens ist die embryonale Entwicklung schnell; Es dauert nur ein paar tage für das gesamte vasculature zu entwickeln, während welcher zeit das entwickelnde vaskul Ature kann abgebildet werden. Drittens sind genetische und pharmakologische Interventionen vor und während der Gefäßbildung leicht durchzuführen, wie durch die Mikroinjektion von Antisense-Morpholino-Nukleotiden (MOs) in den sich entwickelnden Embryo oder durch die Badanwendung der Medikamente 3 , 4 , 5 .

Der einmalige Vorteil von Xenopus über Zebrafisch ist, dass embryologische Manipulationen durchgeführt werden können, weil Xenopus stereotypen holoblastischen Spaltungen folgt und die embryonale Schicksalskarte gut definiert ist 6 . Beispielsweise ist es möglich, einen Embryo zu erzeugen, bei dem nur eine laterale Seite genetisch manipuliert wird, indem man ein Antisense-MO zu einer Zelle im Zweizellenstadium injiziert. Es ist auch möglich, das Herz-Primordium von einem Embryo zu einem anderen zu transplantieren, um zu bestimmen, ob das Gen seine Funktion durch einen zell-intrinsischen oder -extrinsischen Mechanismus ausübtAss = "xref"> 7 Obwohl diese Techniken meist in Xenopus laevis entwickelt wurden, das allotetraploid ist und daher nicht ideal für genetische Studien ist, können sie direkt auf Xenopus tropicalis angewendet werden , eine eng verwandte diploide Spezies 8 .

Eine Möglichkeit, die Vaskulatur in einem lebenden Xenopus- Embryo zu visualisieren, besteht darin, einen Fluoreszenzfarbstoff zu injizieren, um die Blutgefäße zu etikettieren. Acetyliertes Lipoprotein mit niedriger Dichte (AcLDL), das mit einem fluoreszierenden Molekül wie DiI markiert ist, ist eine sehr nützliche Sonde. Im Gegensatz zu nichtacetyliertem LDL bindet AcLDL nicht an den LDL-Rezeptor 9, sondern wird durch Makrophagen und Endothelzellen endozytiert. Die Injektion von DiI-AcLDL in das Herz eines lebenden Tieres führt zu einer spezifischen fluoreszierenden Markierung von Endothelzellen, und das gesamte Gefäßsystem kann durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden oder fixierten Embryonen abgebildet werden 4 .

Hier haben wir vorDetaillierte Protokolle für die Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßen mit DiI-AcLDL in Xenopus tropicalis ( Abbildung 1 ). Wir bieten wichtige praktische Punkte, mit Beispielen für erfolgreiche und erfolglose Experimente. Darüber hinaus bieten wir eine einfache Methode zur quantitativen Analyse der vaskulären Komplexität, die bei der Beurteilung der Auswirkungen von genetischen und umweltbedingten Faktoren auf die Formgebung des Gefäßnetzes nützlich sein könnte.

Protocol

Alle Experimente erfüllten die Protokolle, die von der Yonsei University College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt wurden. 1. Vorbereitung von Xenopus tropicalis Embryos ANMERKUNG : Xenopus tropicalis Embryos wurden wie zuvor beschrieben 10 mit leichter Modifikation hergestellt. Xenopus tropicalis Embryos wurden nach den Tabellen von Nieuwkoop und Faber 11 inszeniert. <…

Representative Results

Zeitplan der Experimente (Abb. 1 und 2) Kurz nach der Befruchtung kann eine gezielte Mikroinjektion durchgeführt werden, um die Genexpression zu modulieren. Beispielsweise kann ein Antisense-MO, das spezifisch an das Initiationscodon der endogenen Tie2-mRNA bindet, injiziert werden, was die Translation von Tie2-Ziel-mRNA durch sterische Hinderung hemmt. Ein MO kann mit Fluorescein für die einfache visuelle Screening von erfolgr…

Discussion

Das hier vorgestellte Protokoll wurde zuerst von Ali H. Brivanlou und Kollegen entwickelt, um Entwicklungsereignisse während der Gefäßbildung in Xenopus laevis 4 zu untersuchen, aber wie in diesem Manuskript gezeigt, kann es auf andere kleine Tiere angewendet werden. Die Farbinjektion in das Herz ist einfach durchzuführen, und das gesamte Gefäßnetzwerk kann unter einem Fluoreszenzdissektionsmikroskop sowie ein konfokales Mikroskop abgebildet werden. Wenn der Farbstoff während der …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von der Arbeit von Levine et al. , Die diese experimentelle Methode beschrieben und eine umfassende Beschreibung der vaskulären Entwicklung in Xenopus laevis zur Verfügung stellte . Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre Inputs. Diese Studie wurde von der Yonsei University Future-führenden Forschungsinitiative von 2015 (2015-22-0095) und dem Bio & Medical Technology Development Program der Nationalen Forschungsstiftung (NRF) unterstützt, die vom Ministerium für Wissenschaft, IKT & Zukunftsplanung ( NRF-2013M3A9D5072551)

Materials

35mm Petri dish SPL 10035 Sylgard mold frame
60mm Petri dish SPL 10060 Embryo raising tray
Borosilicate Glass Sutter instrument B100-50-10 Needle for injection
BSA Sigma A3059-10G Coating reagent
CaCl2 D.S.P.GR Reagent 0.1X MBS component
Coverslip Superior HSU-0111520 For confocal imaging
DiI-AcLDL Thermo Fisher Scientific L3484 Vessel staining solution
FBS Hyclone SH.30919.02 For storage of testis
Fiber Optical Illuminator World Precision Instruments Z-LITE-Z Light
Ficoll Sigma F4375 Injection buffer
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter instrument P-97 Injection needle puller
Forcep Fine Science Tool 11255-20 For embryo hatching and
needle tip cutting
Glass Bottom dish SPL 100350 For confocal imaging
hCG MNS Korea For priming of frogs
HEPES Sigma H3375 Buffering agent
Incubator Lab. Companion ILP-02 For raising embryos
KCl DAEJUNG 6566-4400 MBS component
L15 medium Gibco 11415-114 For storage of testis
L-cysteine Sigma 168149-100G De-jellying reagent
MgSO4 Sigma M7506 MBS component
Microtube Axygen MCT-175-C-S For storage of testis
MS222 Sigma E10521 Anesthetic powder
NaCl DAEJUNG 7647-14-5 MBS component
NaOH Sigma S-0899 pH adjusting reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Fixatives
PBS BIOSESANG P2007 Buffer for imaging
pH paper Sigma P4536-100EA For confirming pH
PICO-LITER INJECTOR Waner instruments PLI-100A For injection
Pin Pinservice 26002-10 For incision
Pinholder Scitech Korea 26016-12 For incision
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope World Precision Instruments PZMIII For visual screening
Standard Manual Control Micromanipulator  Waner instruments W4 64-0056 For microinjection
SYLGARD 184 Kit Dow Corning For DiI injection
Transfer pipette Korea Ace Scientific Co. YM.B78-400 For eggs and
embryo collection

参考文献

  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
  3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
  4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
  5. Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
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記事を引用
Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).

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