概要

Visualisation et analyse quantitative de l'angiogenèse embryonnaire dans<em> Xenopus tropicalis</em

Published: May 25, 2017
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概要

Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .

Abstract

Les vaisseaux sanguins fournissent de l'oxygène et des nutriments dans tout le corps, et la formation du réseau vasculaire est soumise à un contrôle étroit du développement. La visualisation efficace in vivo des vaisseaux sanguins et la quantification fiable de leur complexité sont essentielles à la compréhension de la biologie et de la maladie du réseau vasculaire. Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour visualiser les vaisseaux sanguins avec un colorant fluorescent disponible dans le commerce, un complexe DII-lipoprotéine à faible densité acétylée plasmatique humain (DiI-AcLDL) et à quantifier leur complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être étiquetés par une simple injection de DiI-AcLDL dans le coeur battant d'un embryon, et les vaisseaux sanguins dans l'ensemble de l'embryon peuvent être imagés dans des embryons vivants ou fixes. Combinée à la perturbation du gène par la micro-injection ciblée d'acides nucléiques et / ou l'application du bain de réactifs pharmacologiques, les rôles d'un gène ou d'une voie de signalisation sur le développement vasculaire peuvent être inveStigmatisé dans une semaine sans recourir à des animaux génétiquement modifiés. En raison du système veineux bien défini de Xenopus et de son angiogenèse stéréotypée, la germination des vaisseaux préexistants, la complexité des vaisseaux peut être quantifiée efficacement après les expériences de perturbation. Ce protocole relativement simple devrait servir d'outil facilement accessible dans divers domaines de la recherche cardiovasculaire.

Introduction

La vasculogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins provenant de cellules endothéliales nouvellement nées et l'angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants sont deux processus distincts qui forment la vascularisation embryonnaire 1 . Toute dysrégulation dans ces processus entraîne diverses maladies cardiaques et anomalies structurelles des vaisseaux. En outre, la croissance tumorale est associée à une croissance non surveillée des vaisseaux. En tant que tel, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la vasculogenèse et à l'angiogenèse font l'objet d'une enquête intense 2 .

Xenopus et le poisson zèbre sont des modèles attrayants de vertébrés pour les études de vasculogenèse et d'angiogenèse, pour plusieurs raisons. Premièrement, leurs embryons sont petits; Par conséquent, il est relativement facile d'imaginer l'ensemble du système vasculaire. Deuxièmement, le développement embryonnaire est rapide; Il ne faut que quelques jours pour développer l'ensemble du système vasculaire, période pendant laquelle le vasculisme en développement L'image peut être imagée. Troisièmement, les interventions génétiques et pharmacologiques avant et pendant la formation des vaisseaux sont faciles à réaliser, par exemple grâce à la micro-injection de nucléotides morpholino-antisens (MO) dans l'embryon en développement ou par l'application du bain de médicaments 3 , 4 , 5 .

L'avantage unique de Xenopus sur le poisson zèbre est que des manipulations embryologiques peuvent être effectuées car Xenopus suit des clivages holoblastiques stéréotypés et la carte du sort embryonnaire est bien définie 6 . Par exemple, il est possible de générer un embryon dans lequel un seul côté latéral est manipulé génétiquement en injectant un MO antisens à une cellule au stade à deux cellules. Il est également possible de transplanter le primordium cardiaque d'un embryon à un autre pour déterminer si le gène exerce sa fonction par un mécanisme cellulaire intrinsèque ou extrinsèqueAss = "xref"> 7. Bien que ces techniques aient surtout été développées chez Xenopus laevis , qui est allotetraploïde et n'est donc pas idéale pour les études génétiques, elles peuvent être directement appliquées à Xenopus tropicalis , une espèce diploïde étroitement liée 8 .

Une façon de visualiser le système vasculaire dans un embryon Xenopus vivant consiste à injecter un colorant fluorescent pour étiqueter les vaisseaux sanguins. La lipoprotéine de basse densité acétylée (AcLDL) marquée avec une molécule fluorescente telle que DiI est une sonde très utile. Contrairement aux LDL non acétylées, les LDL ne se lient pas au récepteur LDL 9 mais sont endocytées par les macrophages et les cellules endothéliales. L'injection de DiI-AcLDL dans le cœur d'un animal vivant entraîne l'étiquetage spécifique des cellules endothéliales par fluorescence et toute la vascularisation peut être imagée par microscopie fluorescente dans des embryons vivants ou fixes 4 .

Ici, nous présDes protocoles détaillés pour la visualisation et la quantification des vaisseaux sanguins utilisant DiI-AcLDL dans Xenopus tropicalis ( figure 1 ). Nous fournissons des points pratiques clés, avec des exemples d'expériences réussies et infructueuses. En outre, nous fournissons une méthode simple pour l'analyse quantitative de la complexité vasculaire, ce qui pourrait être utile pour évaluer les effets des facteurs génétiques et environnementaux sur la mise en forme du réseau vasculaire.

Protocol

Toutes les expériences ont respecté les protocoles approuvés par les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Université de Yonsei. 1. Préparation des embryons de Xenopus tropicalis NOTE: Les embryons de Xenopus tropicalis ont été produits comme décrit précédemment 10 , avec une légère modification. Les embryons de Xenopus tropicalis ont été mis en …

Representative Results

Chronologie des expériences (figures 1 et 2) Peu de temps après la fécondation, une micro-injection ciblée peut être effectuée pour moduler l'expression des gènes. Par exemple, un MO antisens qui se lie spécifiquement au codon d'initiation de l'ARNm Tie2 endogène peut être injecté, inhibant la traduction de l'ARNm cible Tie2 par un empêchement stérique. Un MO peut être conjugué à la fluorescéine p…

Discussion

Le protocole présenté ici a d'abord été développé par Ali H. Brivanlou et ses collègues pour enquêter sur les événements de développement lors de la formation vasculaire dans Xenopus laevis 4 , mais, comme le montre ce manuscrit, il peut être appliqué à d'autres petits animaux. L'injection de teinture dans le cœur est simple à réaliser, et l'ensemble du réseau vasculaire peut être imagé sous un microscope à dissection de fluorescence, ainsi qu'un …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été inspirée par le travail de Levine et al. , Qui décrit cette méthode expérimentale et fournit une description complète du développement vasculaire chez Xenopus laevis. Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leur contribution. Cette étude a été soutenue par l'Initiative de recherche de l'Université de Yonsei en 2015 (2015-22-0095) et le Programme de développement de la technologie biologique et médicale de la Fondation nationale de la recherche (NRF) financé par le ministère des Sciences, des TIC et de la planification future ( NRF-2013M3A9D5072551)

Materials

35mm Petri dish SPL 10035 Sylgard mold frame
60mm Petri dish SPL 10060 Embryo raising tray
Borosilicate Glass Sutter instrument B100-50-10 Needle for injection
BSA Sigma A3059-10G Coating reagent
CaCl2 D.S.P.GR Reagent 0.1X MBS component
Coverslip Superior HSU-0111520 For confocal imaging
DiI-AcLDL Thermo Fisher Scientific L3484 Vessel staining solution
FBS Hyclone SH.30919.02 For storage of testis
Fiber Optical Illuminator World Precision Instruments Z-LITE-Z Light
Ficoll Sigma F4375 Injection buffer
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter instrument P-97 Injection needle puller
Forcep Fine Science Tool 11255-20 For embryo hatching and
needle tip cutting
Glass Bottom dish SPL 100350 For confocal imaging
hCG MNS Korea For priming of frogs
HEPES Sigma H3375 Buffering agent
Incubator Lab. Companion ILP-02 For raising embryos
KCl DAEJUNG 6566-4400 MBS component
L15 medium Gibco 11415-114 For storage of testis
L-cysteine Sigma 168149-100G De-jellying reagent
MgSO4 Sigma M7506 MBS component
Microtube Axygen MCT-175-C-S For storage of testis
MS222 Sigma E10521 Anesthetic powder
NaCl DAEJUNG 7647-14-5 MBS component
NaOH Sigma S-0899 pH adjusting reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Fixatives
PBS BIOSESANG P2007 Buffer for imaging
pH paper Sigma P4536-100EA For confirming pH
PICO-LITER INJECTOR Waner instruments PLI-100A For injection
Pin Pinservice 26002-10 For incision
Pinholder Scitech Korea 26016-12 For incision
Precision Stereo Zoom Binocular Microscope World Precision Instruments PZMIII For visual screening
Standard Manual Control Micromanipulator  Waner instruments W4 64-0056 For microinjection
SYLGARD 184 Kit Dow Corning For DiI injection
Transfer pipette Korea Ace Scientific Co. YM.B78-400 For eggs and
embryo collection

参考文献

  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
  3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
  4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
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  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
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記事を引用
Ohk, J., Jung, H. Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis. J. Vis. Exp. (123), e55652, doi:10.3791/55652 (2017).

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