概要

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Published: May 25, 2017
doi:

概要

Dieses Protokoll beschreibt histologische Analysen der Leber aus Zebrafisch-Larven, die mit 2% Ethanol für 24 Stunden behandelt wurden. Eine solche akute Ethanolbehandlung führt zu einer hepatischen Steatose und einer Schwellung des Lebergefäßsystems.

Abstract

Alkoholische Lebererkrankung (ALD) bezieht sich auf Schädigung der Leber durch akuten oder chronischen Alkoholmissbrauch. Es gehört zu den führenden Ursachen für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität und betrifft mehr als 2 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten. Ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Alkohol-induzierten Leberverletzung zugrunde liegen, ist entscheidend für die Entwicklung einer effektiven Behandlung für ALD. Zebrafisch-Larven zeigen hepatische Steatose und Fibrogenese nach nur 24 h Exposition gegenüber 2% Ethanol, so dass sie nützlich für die Untersuchung der akuten alkoholischen Leberverletzung. Diese Arbeit beschreibt das Verfahren für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und zeigt, dass es eine Steatose und Schwellung der Leberblutgefäße verursacht. Ein detailliertes Protokoll für Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) -Färbung, das für die histologische Analyse der Zebrafisch-Larvenleber optimiert ist, wird ebenfalls beschrieben. H & E-Färbung hat mehrere einzigartige Vorteile gegenüber der Immunfluoreszenz, da sie alle liv markiertEr-Zellen und extrazellulären Komponenten gleichzeitig und kann leicht erkennen Leber-Verletzungen, wie Steatose und Fibrose. Angesichts der zunehmenden Verwendung von Zebrafisch bei der Modellierung von Toxin und Virus-induzierter Leberverletzung sowie vererbter Lebererkrankungen dient dieses Protokoll als Referenz für die histologischen Analysen, die in all diesen Studien durchgeführt wurden.

Introduction

Alkoholische Lebererkrankung (ALD), die durch Alkoholüberkonsum verursacht wird, ist eine Hauptursache für alkoholbedingte Morbidität und Mortalität. In den Vereinigten Staaten, fast die Hälfte der Leberkrankheit Todesfälle beinhalten Alkohol 1 , und ALD ist verantwortlich für fast 1 in 3 Lebertransplantationen 2 . ALD hat ein breites Spektrum. Die Steatose, die durch eine überschüssige Lipidakkumulation in Hepatozyten charakterisiert ist, tritt im frühen Stadium des schweren Trinkens auf und ist bei Beendigung des Alkoholkonsums reversibel. Unter dem Einfluss von genetischen und umweltbedingten Faktoren und der anhaltenden Alkoholkonsum kann die hepatische Steatose zur alkoholischen Hepatitis und schließlich zur Zirrhose führen. Studien mit dem Nagetier ALD-Modelle haben erhebliche Einblicke in die Krankheit, aber sie haben Einschränkungen (siehe Referenz 3 ). Mündliche Fütterung einer Alkohol-Diät verursacht nur Steatose bei Nagetieren 4 , </ Sup> 5 Entwicklung von Entzündungen und Fibrose erfordert entweder eine zweite Beleidigung 6 , 7 oder chronische intragastrischen Infusion, die invasiv und technisch anspruchsvoll ist 8 , 9 . Der Zeolith des Zeoliths erzeugt auch eine Leberverletzung als Reaktion auf die chronische und akute Alkoholbehandlung 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Insbesondere stellt der Larven-Zebrafisch einen attraktiven komplementären Modellorganismus dar, in dem akute alkoholische Leberverletzungen 10 , 11 , 13 , 15 untersucht werden können . Die Zebrafisch-Leber ist funktionell und produziert Schlüsselenzyme für den Ethanol-Stoffwechsel um 4 TageNach der Befruchtung (dpf) 13 , 16 , 17.Ethanol kann direkt dem Wasser zugesetzt werden, und die Exposition gegenüber 2% Ethanol für 24 h ist ausreichend, um hepatische Steatose und fibrogene Reaktionen in Zebrafischlarven 13 , 15 zu induzieren.

Es wurde berichtet, dass die Behandlung mit 2% Ethanol für 24 h eine Gewebe-Ethanol-Konzentration von 80 mM in Zebrafisch-Larven 13 ergab. Andere haben gezeigt, dass Larven diese Konzentration tolerieren und die Leberphänotypen, die in den behandelten Tieren gesehen werden, spezifisch für die Ethanol-Exposition sind 11 , 13 , 15 , 18 . Da jedoch 80 mM bei Menschen 19 nahezu tödlich ist, ist es wichtig, die Leberhistologie des mit Ethanol behandelten Zebrafischs zu bewerten und zu detektierenRmine die physiologische Relevanz für den Menschen.

Die schnelle externe Entwicklung und Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht es, die Wirkung von Alkohol in der Leber in Echtzeit und in festen Proben zu charakterisieren. Die Verfügbarkeit von zelltypspezifischen fluoreszierenden transgenen Linien und die jüngsten Fortschritte in der konfokalen Mikroskopie erleichtern die Untersuchung, wie verschiedene Leberzelltypen ihre Morphologie und ihr Verhalten in Reaktion auf die akute Ethanolbehandlung 11 , 15 verändern. Allerdings kann die konfokale Bildgebung des fluoreszierenden transgenen Zebrafischs bei der Untersuchung der Leberhistologie nicht vollständig gegen Hämatoxylin und Eosin (H & E) färben. Die Markierung aller Leberzelltypen zur gleichen Zeit mit transgenem Zebrafisch erfordert die Erzeugung von einzelnen transgenen Linien, die jeweils einen Leberzelltyp mit einem einzigartigen Fluorophor markieren. Die Einführung verschiedener transgener Hintergründe in denselben Fisch erfordert BreedinG Mehrfachgenerationen, die zeitaufwändig und teuer ist. Zusätzliche Immunfluoreszenzfärbung ist erforderlich, um extrazelluläre Matrixkomponenten zu detektieren. H & E-Färbung dagegen markiert gleichzeitig alle Leberzelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten und gibt so einen Überblick über die Leber 20 . Darüber hinaus zeigt es leicht einige histopathologische Merkmale von Lebererkrankungen, wie Hepatocyten Tod, Steatose und Fibrose. Obwohl H & E ein routinemäßiger Fleck in der Säugetier-Histologie ist, wird er nicht häufig in der Zebrafisch-Leberforschung verwendet, und das Protokoll ist weniger gut etabliert.

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die akute Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und für die nachfolgenden histologischen Analysen mit H & E-Färbung. Das H & E-Färbeprotokoll kann in allen Studien der Leberentwicklung und -funktion verwendet werden. Darüber hinaus können die Paraffinschnitte für die Immunhistochemie sowie für andere spezielle sta verwendet werdenIns in der Leberpathologie, einschließlich der Trichromfleck, Reticulinfleck usw.

Protocol

AB WT-Erwachsener und Larven-Zebrafisch wurden unter Standardbedingungen 21 gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Institutes of Health Publikation 86-23, überarbeitet 1985) aufrechterhalten; Ihre Verwendung wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee im Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) genehmigt. 1. Vorbereitung von Lösungen Ei-Wasser zubereiten. D…

Representative Results

10% gepuffertes Formalin und 4% Paraformaldehyd (PFA) sind zwei der häufigsten Fixiermittel, die für histologische Praktiken verwendet werden. Allerdings geben sie keine optimalen Fixationsergebnisse für Zebrafisch-Lebergewebe (Abbildung 1 und Tabelle 1 ). Die Fixierung mit 10% Formalin oder 4% PFA führt oft zu Schrumpfungen, wodurch große Lücken zwischen der Leber und den umgebenden Geweben entstehen (Abbildung 1A…

Discussion

Das aktuelle Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur akuten Ethanolbehandlung in Zebrafischlarven und die nachfolgenden histopathologischen Analysen mit H & E-Färbung. Eine akute Ethanolbehandlung sollte nicht früher als 96 h nach der Befruchtung durchgeführt werden, da dies die Stufe ist, in der die Zebrafisch-Leber beginnt, alkohol-metabolisierende Enzyme auszudrücken 13 . 2% Ethanol ist die maximale Dosis, die Larven 13 , <sup class="xref…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Dr. Katy Murray im Zebrafish International Resource Center anerkennen; Dr. Stacey Huppert und Kari Huppert bei CCHMC, für ihre hilfreiche Beratung zum Protokoll; Und CCHMC Veterinärdienst, für die Fischpflege. Diese Arbeit wurde von NIH Grant R00AA020514 und einem Forschungsstipendium vom Zentrum für pädiatrische Genomik bei CCHMC (nach CY) unterstützt. Es wurde auch teilweise unterstützt von NIH grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) der Verdauungsstudie Research Core Center in Cincinnati.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes E & K Scientific 280150
15 mL conical tubes VWR International 89039-664
50 mL conical tubes VWR International 89039-658
95% ethanol Decon Labs, Inc. 2801 Flammable
Acetic acid Newcomer Supply 10010A Irritant
Agarose Research Products International 9012-36-6
Aluminum jar rack holder Newcomer Supply 5300JRK
Bacteriological petri dishes with lid Corning 351029
Biopsy pads Simport M476.1
Charged slides Fisher Scientific 12-550-16
Clear mounting media Fisher Scientific 8310-16 Can be substituted with other clear mounting media
Commercial sea salts Instant Ocean SS15-10
Disposable microtome blades Fisher Scientific 4280L
Dissecting microscope Leica Biosystems Leica Mz 95
Enclosed tissue processor Leica Biosystems ASP300 S
Eosin-Phloxine stain set Newcomer Supply 1082A
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023 Flammable
Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) Sigma-Aldrich 252549 A suspected carcinogen; irritant
Formalin, Buffered, 10% Fisher Scientific SF100-4 A suspected carcinogen; irritant
Graduated media bottle VWR International 16159-520
Harris hematoxylin Poly Scientific R&D Corp. s212 Irritant
Histology molds Sakura Finetek USA Inc 4557
Hot plate/Stirrer VWR International 47751-148
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144 Irritant
Incubator VWR International 97058-220
Insulin syringes BD Medical BD-309301
Inverted compound microscope Carl Zeiss Microscopy 491912-9850-000
Isopropanol Newcomer Supply 12094E Flammable
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Irritant
Microtome Leica Biosystems Leica Jung BioCut 2035 
Nutating mixer VWR International 82007-202
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-1KG A suspected carcinogen; irritant
Pasteur pipet VWR International 53283-916
Pipette pump (10 mL) VWR International 53502-233
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791
Razor blades Grainger 4A807
Slide Staining Kit Newcomer Supply 5300KIT
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher BioReagents S318-500 Very hazardous
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S3264
Stainless steel strainer (5 inch diameter) Adaptive Science Tools L0906045in
Tissue cassettes Simport M505.12
Tissue embedding center Sakura Finetek USA Inc #5100
Tissue wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06666A
Transfer pipets Fisher Scientific 137117M
Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich A5040 Irritant
Tris base, primary standard and buffer Sigma-Aldrich T1503
Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth Nalge Nunc International 2402-0750
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 Irritant

参考文献

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記事を引用
Ellis, J. L., Yin, C. Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish. J. Vis. Exp. (123), e55630, doi:10.3791/55630 (2017).

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