Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

1. Colocación de Bibliotecas de Inhibidores de Quinasa de Pequeña Molécula Agrupar las librerías inhibidoras de las colecciones de inhibidores de quinasa accesibles al público, por ejemplo , la Biblioteca de Redes Integradas de Firmas Celulares (LINCS) de Harvard Medical School, una colección selectiva de 228 potentes y selectivos inhibidores de quinasa (http://lincs.hms.harvard.edu) , Y el conjunto de inhibidores de la proteína quinasa (PKIS), una colección de compuestos 376 reunida por investigadores industriales (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativamente, ensamble una colección inhibidora de quinasa a medida de compuestos comercialmente disponibles. NOTA: En nuestro laboratorio, hemos reunido una colección de 72 inhibidores potentes y selectivos de quinasas de herramientas que cubren 51 cinasas objetivo primarias, todas las cuales están disponibles de fuentes comerciales. Ensamble los inhibidores de quinasas en placas de 96 pocillos para un procesamiento óptimo de alto rendimiento en concentraciones múltiples (use 1, 0.1 aNd 0,01 mM). Incluya en cada placa pocillos de control que contengan sólo DMSO e inhibidores de control de referencia PD173074 (FGFRi) y Ruxolitinib (JAKi), que se sabe que promueven los estados pluripotentes naïve y cebado respectivamente. Anotar en una hoja de cálculo o software similar. 2. Condiciones y procedimientos de cultivo de la mESC para la preparación de la pantalla Preparar platos de 10 cm revestidos con gelatina al 0,1% mediante la adición de 5 ml de gelatina al 0,1% (p / v) a placas de 10 cm e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar la gelatina y dejar secar la placa durante 2 min. Cultivo de cualquier línea estándar de mESC a 37 ° C 5% de CO 2 sobre placas de 10 cm revestidas con gelatina al 0,1% en medio MESC estándar (véase Tabla de Materiales) que contiene 100 ng / ml de GST-LIF, 10% de Suero fetal de ternera y 5% Reemplazo. Reemplazar los medios de comunicación todos los días y pasar los mESCs a alrededor del 80% de confluencia cada segundo día a una dilución de 1: 5-1: 10. Al paso mESCs, aspirar los medios y lavar con 5 mL oF de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por placa. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA (tripsina al 0,05%, EDTA al 0,02%) por placa de mESCs e incubar a 37 ° C durante 10 min. Resuspender las células tripsinizadas en 4 ml de medio de mESC y centrifugar a 1.200 rpm durante 5 min. Resuspender completamente el sedimento celular en 5 ml de medio mESC, pipetear hacia arriba y hacia abajo para generar una única suspensión celular. Contar las células mediante la combinación de una suspensión de 10 μL de células y 10 μ l de azul Trypan (0,4%). Coloque en una cámara de recuento de células o utilice un hemocitómetro y un microscopio óptico. Se sembró 3 x 10 3 mESCs en placas de 96 pocillos revestidas con gelatina al 0,1%, volumen final 100 μl de medio, usando una pipeta multicanal. Aplique inhibidores de quinasa a una dilución de 1: 100 (1 μl de inhibidor añadido a 100 μl de medio) usando una pipeta multicanal. Pipetar suavemente los medios para mezclar el inhibidor y la suspensión celular, luego dejar que las células se asienten en una campana de cultivo de tejidos durante 1 h para asegurar una distribución igual de acroSs la superficie de la galjanoplastia. Células de cultivo durante 48 h sin cambiar los medios. NOTA: Las placas de reserva de 1 / 0.1 / 0.01 mM darán una concentración de inhibidor final de 10/1 / 0.1 μM, respectivamente. Se recomienda iniciar la pantalla a una concentración final de 1 μM para asegurar la inhibición efectiva de las quinasas diana primarias, al mismo tiempo que se minimizan los efectos fuera de destino. 3. Análisis de detección de inhibidores de quinasa Lavar las placas mESC de 96 pocillos en 200 μl de PBS usando un aspirador multicanal y pipetas. Hacer extractos celulares en 150 μl de tampón de lisis (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 al 1% (v / v), desoxicolato de sodio al 0,5% (p / v), β-glicerofosfato 10 mM , Pirofosfato sódico 10 mM, NaF 1 mM, Na _ { 3 } VO _ {4} 2 mM, Comprimidos completos para cocteleros con inhibidores de proteasas). Aclarar los extractos por centrifugación a 1.500 xg durante 30 min en placas de 96 pocillos de fondo en V. Inmovilizar 100 μL de sobrenadantes en un nitrocelDe membrana de lulosa utilizando un colector de puntos de vacío de 96 pocillos. Seque la membrana y se mancha con 40 mL de Ponceau S para asegurar una transferencia consistente. Lavar la membrana con TBST y bloquear en TBST / 3% (p / v) de leche. Incubar en anticuerpos Nanog y Dnmt3b a una dilución de 1: 1.000 (v / v) en TBST / 3% (p / v) de leche en polvo durante la noche. Lavar las membranas en 3 x 10 min en TBST e incubar en 30 ml de anticuerpos secundarios a una dilución de 1: 10.000 (v / v) en TBST / 3% (p / v) de leche. Desarrollar utilizando un sistema de imagen inmunoblotting digital. NOTA: Si es posible, utilice inmunoblotting de fluorescencia cuantitativa para detectar Nanog y Dnmt3b. Sin embargo, la señal de fondo para Dnmt3b por inmunotransferencia de fluorescencia es demasiado alta. Por lo tanto, se utilizan anticuerpos secundarios de fluorescencia anti-conejo (Nanog) y anti-ratón-HRP (Dnmt3b) de 800 nm. 4. Análisis de datos de pantalla y validación de inhibidores como reguladores de pluripotencia de buena fe <p class="jove_content"> NOTA: Este es un paso crítico para asegurar que sólo se identifiquen moduladores de pluripotencia de buena fe. Es esencial triar inhibidores basados ​​tanto en la relación Nanog: Dnmt3b como en la señal global, para asegurar que los inhibidores de quinasa que afectan negativamente a la supervivencia de mESC no se seleccionan para un análisis posterior. Cuantificar la señal de Nanog y Dnmt3b utilizando el software de análisis de inmunotransferencia e importar valores en una hoja de cálculo o software similar. Calcular la relación Nanog: Dnmt3b para todas las muestras en comparación con el control de DMSO. Además, determinar la señal total de Nanog y Dnmt3b para asegurar que los inhibidores de la quinasa no afectan a la relación Nanog: Dnmt3b alterando la viabilidad del mESC. Utilizar relaciones Nanog: Dnmt3b para identificar inhibidores que promuevan la pluripotencia ingenua (relación Nanog: Dnmt3b mayor que el control) y pluripotencia (Nanog: Dnmt3b ratio inferior al control). Ajustar el corte a una desviación de 2x de los valores de control, y filtrar los inhibidores de quinasa que producen una señal Nanog + Dnmt3b total de menos que50% del valor de control de DMSO para generar una lista de confianza alta de inhibidores de quinasa que estabilizan los estados pluripotentes naïve (alto Nanog: Dnmt3b ratio) y primado (bajo Nanog: Dnmt3b ratio). Validar los inhibidores de la quinasa mediante la siembra de mESCs a 2 x 10 5 células por 6 pocillos en 2 ml de medio y añadir inhibidores de quinasa a 1 μM durante 48 h, sin cambiar los medios. Lyse mESCs en tampón de lisis y analizar la expresión de Nanog y Dnmt3b por inmunotransferencia SDS-PAGE convencional. Además validar hits por SDS-PAGE immunoblotting para naïve pluripotencia marcadores Klf2 y Klf4, y Oct4 para garantizar que la pluripotencia se mantiene después de 48 h de tratamiento con inhibidores.