Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

1. Collatie van Kinase-inhibitorbibliotheken met kleine molecuul Combineer remmerbibliotheken uit publiek toegankelijke kinaseremmerscollecties, bijv. Library of Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) van Harvard Medical School, een gerichte verzameling van 228 krachtige en selectieve kinaseremmers (http://lincs.hms.harvard.edu) , En de Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), een collectie van 376 samengesteld door industriële onderzoekers (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternatief, assembleer een op maat gemaakte kinaseremmer collectie uit commercieel verkrijgbare verbindingen. OPMERKING: In ons laboratorium hebben we een verzameling van 72 krachtige en selectieve gereedschapskinaseremmers samengesteld die 51 primaire doelkinasen omvatten, die allemaal uit commerciële bronnen verkrijgbaar zijn. Kinase-remmers monteren in platen met 96 putjes voor optimale verwerking met hoge doorvoer bij meerdere concentraties (gebruik 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Inclusief in elke plaat controlebronnen die alleen DMSO bevatten en referentie controle inhibitors PD173074 (FGFRi) en Ruxolitinib (JAKi), die bekend zijn om respectievelijk naïeve en priide pluripotente staten te bevorderen. Annoteren in een spreadsheet of soortgelijke software. 2. MESC Cultuur Voorwaarden en Procedures voor Scherm Voorbereiding Bereid 0,1% gelatine gecoate 10 cm schotels door 5 ml 0,1% (w / v) gelatine aan 10 cm platen toe te voegen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Aspirateer de gelatine en laat de plaat gedurende 2 minuten drogen. Cultuur elke standaard mESC lijn bij 37 ° C 5% CO 2 op 0,1% gelatine beklede 10 cm gerechten in standaard mESC media (zie Material Table ) die 100 ng / ml GST-LIF, 10% Fetaal Kalf Serum en 5% Knockout Serum bevat Vervanging. Vervang media elke dag en plaats de mESC's bij ongeveer 80% confluency elke tweede dag bij een verdunning van 1: 5-1: 10. Om mESC's door te geven, aspireren media en was met 5 ml oF fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per plaat. Voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,05% trypsine, 0,02% EDTA) per plaat mESC's toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Resuspendeerde trypsineerde cellen in 4 ml mESC media en centrifuge bij 1200 rpm gedurende 5 min. Cellulaire pellets opnieuw resuspeneren in 5 ml mESC media, pipetteren omhoog en omlaag om een ​​enkele cel suspensie te genereren. Tel cellen met een 10 μL cel suspensie en 10 μl Trypan Blue (0,4%). Plaats in een cel telkamer of gebruik een hemocytometer en lichtmicroscoop. Zaad 3 x 10 3 mESCs in 0,1% gelatine gecoate 96 putjes platen, eindvolume 100 ul media, met behulp van een multikanaalspipet. Kinase remmers toepassen bij 1: 100 verdunning (1 μL remmer toegevoegd aan 100 μL media) met behulp van een multi-channel pipet. Zachtjes pipette media om remmer en cel suspensie te mengen, laat dan toe dat cellen gedurende 1 uur in een weefselkweekhoofd komen om gelijkwaardige verdeling acro te waarborgenZoals het plating oppervlak. Cultuurcellen gedurende 48 uur zonder de media te veranderen. OPMERKING: Voorraadplaten van 1 / 0,1 / 0,01 mM geven respectievelijk een eindconcentratie van 10/1 / 0,1 μM. We raden aan om het scherm te starten bij een eindconcentratie van 1 μM om effectieve remming van primaire doelkinasen te waarborgen, terwijl de off-target effecten worden beperkt. 3. Kinase Inhibitor Screening Analysis Was 96 ml MESC platen in 200 μL PBS met behulp van meerdere kanalen aspirator en pipetten. Maak celextracten in 150 μl lysisbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% natriumdeoxycholaat (w / v), 10 mM ß-glycerofosfaat , 10 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM NaF, 2 mM Na3VO4, Cocktail Tabletten van volledige Protease Inhibitor). Verhelder extracten door centrifugeren bij 1.500 xg gedurende 30 minuten in V-bodemplaten met 96 putjes. Immobiliseer 100 μl supernatanten op een nitrocelLulose membraan met behulp van een 96-putjes vacuum dot blot manifold. Droog het membraan en vlek met 40 ml Ponceau S om de consistente overdracht te waarborgen. Was membraan met TBST en blokkeer in TBST / 3% (w / v) melk. Incubeer in Nanog en Dnmt3b antilichamen bij een verdunning van 1: 1000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) melkpoeder overnacht. Was membranen in 3 x 10 minuten in TBST en incubeer in 30 ml secundaire antilichamen bij een verdunning van 1: 10.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) melk. Ontwikkel met behulp van een digitaal immunoblottend beeldvormingssysteem. OPMERKING: Gebruik indien mogelijk kwantitatieve fluorescentie immunoblotting om Nanog en Dnmt3b te detecteren. Het achterliggende signaal voor Dnmt3b door fluorescentie immunoblotting is echter te hoog. Daarom worden secundaire antilichamen van 800 nm fluorescentie anti-konijn (Nanog) en anti-muis-HRP (Dnmt3b) gebruikt. 4. Analyse van schermdata en validatie van inhibitors als Bona Fide Pluripotency Regulators <p class="jove_content"> OPMERKING: Dit is een kritische stap om ervoor te zorgen dat alleen bona fide pluripotencymodulatoren worden geïdentificeerd. Het is essentieel om triageren op basis van zowel de nanog: dnmt3b verhouding als het algemene signaal te verzekeren, om ervoor te zorgen dat kinase remmers die het mESC-overleving nadelig beïnvloeden, niet worden geselecteerd voor verdere analyse. Kwantificeer Nanog en Dnmt3b signaal met behulp van immunoblotting analyse software, en importeer waarden in een spreadsheet of soortgelijke software. Bereken Nanog: Dnmt3b verhouding voor alle monsters in vergelijking met DMSO controle. Bepaal ook het totale Nanog en Dnmt3b signaal om ervoor te zorgen dat kinaseremmers de nier- en dnmt3b-verhouding niet beïnvloeden door de mESC-levensvatbaarheid te veranderen. Gebruik gerangschikt Nanog: Dnmt3b verhoudingen om remmers te identificeren die naïeve pluripotency (Nanog: Dnmt3b ratio hoger dan controle) en geperforeerde pluripotency (Nanog: Dnmt3b ratio lager dan controle) identificeren. Zet afsnijding bij 2x afwijking van de controlewaarden en filter kinaseremmers uit die een totaal Nanog + Dnmt3b signaal van minder dan dat produceren50% van de DMSO controle waarde om een ​​hoge vertrouwen lijst van kinase remmers te genereren die naïeve stabiliteit (hoge nanog: Dnmt3b ratio) en geperste pluripotentestanden (lage Nanog: Dnmt3b ratio) stabiliseren. Valideer kinase remmers door mESCs te zaaien bij 2 x 10 5 cellen per 6 putjes in 2 ml media, en voeg kinase remmers bij 1 μM gedurende 48 uur toe zonder media te veranderen. Lyse mESC's in lysisbuffer en analyseren Nanog en Dnmt3b expressie door conventionele SDS-PAGE immunoblotting. Verdere valideren van hits door SDS-PAGE immunoblotting voor naïeve pluripotentie markers Klf2 en Klf4 en Oct4 om ervoor te zorgen dat pluripoten wordt gehandhaafd na 48 uur inhibitor behandeling.