通过高通量抑制剂筛选鉴定调节胚胎干细胞多能性的激酶的简单方法

小分子激酶抑制剂库的整理来自可公开获得的激酶抑制剂收集物的分页抑制剂文库， 例如来自哈佛医学院的基于综合网络的细胞标记库（LINCS），228种有效和选择性激酶抑制剂的靶向收集物（http://lincs.hms.harvard.edu） ，和蛋白激酶抑制剂组（PKIS），由工业研究人员（https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS）组装的376化合物收集品13 。或者，从市售化合物组装定制的激酶抑制剂收集物。 注意：在我们的实验室，我们汇集了一系列72种有效和选择性的工具激酶抑制剂，涵盖51种主要靶向激酶，所有这些都可从商业来源获得。 将激酶抑制剂装配到96孔板中，以实现多种浓度的最佳高通量处理（使用1，0.1 and 0.01mM）。包括在含有DMSO的每个平板对照孔和参考对照抑制剂PD173074（FGFRi）和Ruxolitinib（JAKi）中，其分别促进幼稚和引发的多能态。在电子表格或类似软件中注释。 2. mESC培养条件和筛选程序通过向10厘米平板中加入5毫升0.1％（w / v）明胶制备0.1％明胶包被的10厘米培养皿，并在室温下孵育5分钟。吸出明胶，让板干燥2分钟。 在含有100ng / mL GST-LIF，10％胎牛血清和5％敲除血清的标准mESC培养基（参见材料表 ）中，在37℃5％CO 2的0.1％明胶包被的10cm培养皿上培养任何标准mESC系替代。每天更换培养基，通过mESCs，每隔约80％汇合，稀释1：5-1：10。 通过mESCs，吸出培养基并用5 mL o洗涤f磷酸盐缓冲盐水（PBS）。 加入每平板mESCs 1 mL胰蛋白酶EDTA（0.05％胰蛋白酶，0.02％EDTA），37℃孵育10 min。 将胰蛋白酶处理的细胞重悬于4mL的mESC培养基中，并以1,200rpm离心5分钟。 在5mL的mESC培养基中彻底重悬细胞沉淀，上下移液以产生单细胞悬液。 通过将10μL细胞悬浮液和10μL台盼蓝（0.4％）组合计数细胞。放入细胞计数室或使用血细胞计数器和光学显微镜。 将3×10 3个 mESC种子加入到0.1％明胶包被的96孔板中，最终体积为100μL的培养基，使用多通道移液管。 使用多通道移液器，以1:100稀释（1μL抑制剂加入100μL培养基）中应用激酶抑制剂。轻轻移液培养基以混合抑制剂和细胞悬浮液，然后使细胞在组织培养罩中沉降1小时以确保相等分布acro电镀表面。培养细胞48h，不改变培养基。 注意：1 / 0.1 / 0.01mM的储备板将分别给出10/1 /0.1μM的最终抑制剂浓度。我们建议以1μM的最终浓度启动荧光屏，以确保有效抑制主要靶激酶，同时最大限度地减少目标效应。 激酶抑制剂筛选分析使用多通道吸气器和移液管在200μLPBS中洗涤96孔mESC平板。 在150μL裂解缓冲液（20mM Tris pH7.4,150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40（v / v），0.5％脱氧胆酸钠（w / v），10mMβ-甘油磷酸钠，10mM焦磷酸钠，1mM NaF，2mM Na 3 VO 4 ，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片）。 通过在V底96孔板中以1,500×g离心30分钟澄清提取物。 将100μL上清液固定在硝基上lulose膜使用96孔真空斑点印迹歧管。 干燥膜，并用40毫升Ponceau S染色，以确保一致的转印。 用TBST洗涤膜，并在TBST / 3％（w / v）牛奶中封闭。 以1：1,000（v / v）稀释于TBST / 3％（w / v）奶粉中的Nanog和Dnmt3b抗体孵育过夜。 在TBST中以3×10分钟洗涤膜，并在TBST / 3％（w / v）牛奶中稀释1:10（v / v）的30mL二级抗体中孵育。 开发使用数字免疫印迹成像系统。 注意：如果可能，使用定量荧光免疫印迹检测Nanog和Dnmt3b。然而，通过荧光免疫印迹对Dnmt3b的背景信号太高。因此，使用800nm荧光抗兔（Nanog）和抗小鼠HRP（Dnmt3b）二抗。 4.筛选数据分析和抑制剂作为真菌多能调节剂的验证<p class="jove_content">注意：这是确保只有善意的多能调节剂被识别的关键步骤。基于Nanog：Dnmt3b比率和总体信号，分离抑制剂是必要的，以确保不会影响mESC存活的激酶抑制剂不被选择用于进一步分析。 使用免疫印迹分析软件量化Nanog和Dnmt3b信号，并将值导入电子表格或类似软件。与DMSO对照相比，计算所有样品的Nanog：Dnmt3b比例。此外，确定总Nanog和Dnmt3b信号，以确保激酶抑制剂通过改变mESC活力不影响Nanog：Dnmt3b比例。 使用排列的Nanog：Dnmt3b比率来鉴别促进幼稚多能性（Nanog：Dnmt3b比高于对照）和引发多能性（Nanog：Dnmt3b比低于对照）的抑制剂。将截止值设置为与对照值的2倍偏差，并过滤掉产生总Nanog + Dnmt3b信号的激酶抑制剂50％的DMSO对照值，以产生稳定初始（高Nanog：Dnmt3b比）和引发（低Nanog：Dnmt3b比）多能态的激酶抑制剂的高置信列表。 通过在2mL培养基中每6孔以2×10 5个细胞接种mESC来验证激酶抑制剂，并在1μM下加入激酶抑制剂48小时，而不改变培养基。 Lyse mESCs在裂解缓冲液中，通过常规SDS-PAGE免疫印迹分析Nanog和Dnmt3b表达。 通过SDS-PAGE免疫印迹进一步验证初始多能性标记Klf2和Klf4以及Oct4，以确保48小时抑制剂治疗后保持多能性。