Простой метод для идентификации киназ, которые регулируют плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток посредством высокопроизводительного скрининга ингибиторов

1. Сборка библиотек ингибиторов киназы малых молекул Объединение библиотек ингибиторов из общедоступных коллекций ингибиторов киназы, например Библиотека интегрированных сетевых клеточных сигнатур (LINCS) Гарвардской медицинской школы, целевая коллекция из 228 сильнодействующих и селективных ингибиторов киназы (http://lincs.hms.harvard.edu) , И набора ингибиторов протеинкиназы (PKIS), 376 сборной коллекции, собранной промышленными исследователями (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . В качестве альтернативы, собрать коллекцию ингибиторов киназы из коммерчески доступных соединений. ПРИМЕЧАНИЕ. В нашей лаборатории мы собрали коллекцию из 72 мощных и селективных ингибиторов киназы инструмента, охватывающих 51 первичный целевой киназ, все из которых доступны из коммерческих источников. Собирают ингибиторы киназы в 96-луночные планшеты для оптимальной высокопроизводительной обработки при множественных концентрациях (используйте 1, 0,1 а0,01 мМ). Включить в каждый планшет контрольные лунки, содержащие только ДМСО, и контрольные ингибиторы контроля PD173074 (FGFRi) и Ruxolitinib (JAKi), которые, как известно, способствуют развитию наивных и затравочных плюрипотентных состояний соответственно. Аннотируйте в электронной таблице или подобном программном обеспечении. 2. Условия и процедуры культивирования mESC для подготовки экрана Готовят 0,1% покрытые желатином 10 см чашки, добавляя 5 мл 0,1% (вес / объем) желатина к 10 см чашкам и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Аспирируйте желатин и дайте планшетам высохнуть в течение 2 мин. Культура любая стандартная линия mESC при 37 ° C 5% CO 2 на 0,1% покрытых желатином блюдах 10 см в стандартных средах mESC (см. Таблицу материалов ), содержащих 100 нг / мл GST-LIF, 10% фетальную сыворотку теленка и 5% сыворотки нокаута Замена. Каждый день заменяйте носитель и пропускайте mESC примерно на 80% слияния при разведении 1: 5-1: 10. Для прохода mESC, аспирата и промыть 5 мл оF фосфатно-солевой буфер (PBS) на пластину. Добавить 1 мл трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина, 0,02% ЭДТК) на чашку mESC и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин. Ресуспендируют трипсинизированные клетки в 4 мл среды mESC и центрифугируют при 1200 об / мин в течение 5 мин. Тщательно ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл среды mESC, пипетируя вверх и вниз, чтобы получить суспензию отдельных клеток. Считайте клетки, объединив суспензию клеток 10 мкл и 10 мкл трипанового синего (0,4%). Поместите в камеру подсчета клеток или используйте гемоцитометр и световой микроскоп. Семя 3 × 10 3 mESC на 0,1% покрытых желатином 96-луночных планшетах, конечный объем 100 мкл среды, используя многоканальную пипетку. Применяют ингибиторы киназы при разведении 1: 100 (1 мкл ингибитор добавляется к 100 мкл среды) с использованием многоканальной пипетки. Осторожно пипетируют среду для смешивания ингибитора и клеточной суспензии, затем дают клеткам оседать в вытяжном шкафу для ткани в течение 1 часа, чтобы обеспечить равномерное распределение акроSs поверхность покрытия. Культурные клетки в течение 48 ч без изменения среды. ПРИМЕЧАНИЕ: запасные пластины 1 / 0,1 / 0,01 мМ дают конечную концентрацию ингибитора 10/1 / 0,1 мкМ соответственно. Мы рекомендуем начать экран с конечной концентрацией 1 мкМ, чтобы обеспечить эффективное ингибирование первичных киназ-мишеней, в то же время минимизируя эффекты вне цели. 3. Анализ скрининга ингибиторов киназы Промывают 96-луночные планшеты mESC в 200 мкл PBS, используя многоканальный аспиратор и пипетки. Делают клеточные экстракты в 150 мкл лизирующего буфера (20 мМ Трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40 (об. / Об.), 0,5% дезоксихолата натрия (мас. / Об.), 10 мМ β-глицерофосфата , 10 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ NaF, 2 мМ Na 3 VO 4 , полный коктейль-ингибитор протеазы). Осветляют экстракты центрифугированием при 1500 мкг в течение 30 мин в 96-луночных планшетах с V-дном. Иммобилизуйте 100 мкл супернатантов на нитроцелеЛюлозной мембраны с использованием 96-луночного вакуумного точечного блот-фильтра. Высушите мембрану и окрасьте 40 мл Ponceau S, чтобы обеспечить постоянный перенос. Промыть мембрану TBST и заблокировать TBST / 3% (вес / объем) молока. Инкубируйте в антителах Nanog и Dnmt3b при разведении 1: 1000 (об / об) в TBST / 3% (вес / объем) сухого молока в течение ночи. Промывают мембраны через 3 × 10 мин в TBST и инкубируют в 30 мл вторичных антител при разведении 1: 10000 (об. / Об.) В TBST / 3% (вес / объем) молоке. Разработка с использованием цифровой системы получения изображений с иммуноблоттингом. ПРИМЕЧАНИЕ. Если возможно, используйте количественное флуоресцентное иммуноблоттинга для обнаружения Nanog и Dnmt3b. Однако фоновый сигнал для Dnmt3b с помощью иммуноблоттинга флуоресценции является слишком высоким. Поэтому используют 800 нм флуоресцентные антикроличковые (Nanog) и антимышиные-HRP (Dnmt3b) вторичные антитела. 4. Анализ экранных данных и валидация ингибиторов в качестве добросовестных регуляторов плюрипотентности <p class="jove_content"> ПРИМЕЧАНИЕ. Это важный шаг для обеспечения идентификации только добросовестных модуляторов плюрипотентности. Важно сортировать ингибиторы на основе соотношения Nanog: Dnmt3b и общего сигнала, чтобы гарантировать, что ингибиторы киназы, которые неблагоприятно влияют на выживаемость mESC, не отбираются для дальнейшего анализа. Количественный анализ сигналов Nanog и Dnmt3b с использованием программного обеспечения для анализа иммуноблоттинга и импорт значений в электронную таблицу или подобное программное обеспечение. Рассчитайте отношение Nanog: Dnmt3b для всех образцов по сравнению с контролем DMSO. Также определите общий сигнал Nanog и Dnmt3b, чтобы гарантировать, что ингибиторы киназы не влияют на соотношение Nanog: Dnmt3b, изменяя жизнеспособность mESC. Используйте ранжированные соотношения Nanog: Dnmt3b для идентификации ингибиторов, которые способствуют наивной плюрипотентности (отношение Nanog: Dnmt3b выше, чем контроль) и загрунтованной плюрипотентности (соотношение Nanog: Dnmt3b ниже, чем контроль). Установите отключение при двукратном отклонении от контрольных значений и отфильтровывайте ингибиторы киназы, которые производят общий сигнал Nanog + Dnmt3b, который меньше50% контрольного значения ДМСО для создания списка высокой достоверности ингибиторов киназы, которые стабилизируют наивные (высокое отношение Nanog: Dnmt3b) и праймированные (низкое Nanog: Dnmt3b) плюрипотентные состояния. Проверяйте ингибиторы киназы, посеяв mESC на 2 × 10 5 клеток на 6 лунок в 2 мл среды и добавьте ингибиторы киназы при 1 мкМ в течение 48 часов, не меняя среду. Lyse mESCs в буфере для лизиса и анализируют экспрессию Nanog и Dnmt3b с помощью обычного SDS-PAGE иммуноблоттинга. Дальнейшая проверка обращений с помощью SDS-PAGE иммуноблоттинга для наивных маркеров плюрипотентности Klf2 и Klf4 и Oct4 для обеспечения сохранения плюрипотентности после 48-часовой обработки ингибитором.