Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

1. Colocação de Bibliotecas de Inibidores de Quinase de Pequenas Moléculas Agrupar as bibliotecas de inibidores de colecções de inibidores de quinase publicamente acessíveis, por exemplo , a Biblioteca de Assinaturas Celulares Baseadas em Redes Integradas (LINCS) da Harvard Medical School, uma colecção selectiva de 228 inibidores de cinase potentes e selectivos (http://lincs.hms.harvard.edu) , E o Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), uma colecção de compostos 376 reunida por investigadores industriais (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativamente, montar uma colecção de inibidor de cinase sob medida a partir de compostos comercialmente disponíveis. NOTA: Em nosso laboratório, reunimos uma coleção de 72 potentes e seletivos inibidores de quinase de ferramenta cobrindo 51 cinases-alvo primárias, todas as quais estão disponíveis a partir de fontes comerciais. Reunir inibidores de cinase em placas de 96 poços para processamento ótimo de alto rendimento em concentrações múltiplas (use 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Incluir em cada placa os poços de controlo contendo apenas DMSO e os inibidores de controlo de referência PD173074 (FGFRi) e Ruxolitinib (JAKi), que são conhecidos por promoverem estados pluripotentes inocentes e iniciados respectivamente. Anotar em uma planilha ou software similar. 2. Condições e Procedimentos de Cultura do MESC para a Preparação da Tela Preparar placas de 10 cm revestidas com gelatina a 0,1% por adição de 5 mL de gelatina a 0,1% (p / v) a placas de 10 cm e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar a gelatina e deixar a placa secar durante 2 min. Cultivar qualquer linha mESC padrão a 37 ° C 5% CO 2 em placas de 10 cm revestidas com gelatina a 0,1% em meio mESC padrão (ver Tabela de Materiais) contendo 100 ng / mL de GST-LIF, 10% de Soro Fetal de Bezerro e 5% de Soro Knockout Substituição. Substituir mídia todos os dias e passagem mESCs em cerca de 80% de confluência a cada segundo dia em uma diluição de 1: 5-1: 10. Para a passagem de mESCs, aspirar o meio e lavar com 5 mL deF de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por placa. Adicionar 1 mL de tripsina-EDTA (tripsina a 0,05%, EDTA a 0,02%) por placa de mESCs e incubar a 37 ° C durante 10 min. Ressuspender as células tripsinizadas em 4 mL de meio mESC e centrifugar a 1200 rpm durante 5 min. Ressuspender completamente o sedimento celular em 5 ml de meio mESC, pipetando para cima e para baixo para gerar uma única suspensão celular. Contar células por combinação de 10 μL de suspensão celular e 10 μL de azul de tripano (0,4%). Colocar em uma câmara de contagem de células ou usar um hemocitômetro e microscópio de luz. Semear 3 x 10 3 mESCs em placas de 96 po�s revestidas com gelatina a 0,1%, volume final 100 � de meio, utilizando uma pipeta multicanal. Aplique os inibidores de cinase a uma diluição de 1: 100 (1 μl de inibidor adicionado a 100 μL de meio) utilizando uma pipeta multicanal. Pipetar suavemente a mídia para misturar inibidor e suspensão celular, em seguida, permitir que as células para resolver em uma capa de cultura de tecidos por 1 h para garantir a distribuição igual acroSs a superfície do chapeamento. Células de cultura durante 48 h sem alterar a mídia. NOTA: Placas de reserva de 1 / 0,1 / 0,01 mM darão uma concentração final de inibidor de 10/1 / 0,1 μM, respectivamente. Recomenda-se iniciar o ecr� numa concentra�o final de 1 � para assegurar a inibi�o efectiva das cinases alvo prim�ias enquanto se minimizam os efeitos fora do alvo. 3. Análise de Rastreio de Inibidores de Quinase Lavar 96 placas de mESC bem em 200 μL de PBS usando um aspirador multicanal e pipetas. Preparar extractos celulares em 150 μL de tampão de lise (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 1% (v / v), desoxicolato de sódio a 0,5% (p / v), p-glicerofosfato 10 mM , Pirofosfato de sódio 10 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 2 mM, Comprimidos Completos de Cocktail de Inibidor de Protease). Clarificar os extractos por centrifugação a 1.500 xg durante 30 min em placas de 96 poços de fundo em V. Imobilizar 100 μL de sobrenadantes num nitrocelMembrana de celulose utilizando um colector de manchas ponto de vácuo de 96 poços. Secar a membrana e colorir com 40 mL de Ponceau S para assegurar uma transferência consistente. Lavar a membrana com TBST e bloquear em TBST / 3% (p / v) de leite. Incubar em anticorpos Nanog e Dnmt3b a uma diluição de 1: 1.000 (v / v) em TBST / 3% (p / v) de leite em pó durante a noite. Lavar as membranas em 3 x 10 min em TBST e incubar em 30 mL de anticorpos secundários a uma diluição de 1: 10.000 (v / v) em TBST / 3% (p / v) de leite. Desenvolver usando um sistema de imagem digital imunoblotting. NOTA: Se possível, use fluorescência quantitativa immunoblotting para detectar Nanog e Dnmt3b. No entanto, o sinal de fundo para Dnmt3b por imunoblotting de fluorescência é demasiado elevado. Por conseguinte, são utilizados anticorpos secundários de fluorescência anti-coelho (Nanog) e anti-HRP de ratinho (Dnmt3b) de 800 nm. 4. Análise de Dados de Tela e Validação de Inibidores como Reguladores de Pluripotência Bona Fide <p class="jove_content"> NOTA: Esta é uma etapa crítica para garantir que somente os moduladores de pluripotência de boa-fé sejam identificados. É essencial para os inibidores de triagem com base tanto na relação Nanog: Dnmt3b como no sinal global, para garantir que os inibidores de cinase que afectam adversamente a sobrevivência do mESC não são seleccionados para análise posterior. Quantificar o sinal de Nanog e Dnmt3b usando o software de análise de imunotransferência e importar valores para uma planilha ou software similar. Calcular a relação Nanog: Dnmt3b para todas as amostras em comparação com o controlo do DMSO. Determinar também o sinal de Nanog e Dnmt3b total para assegurar que os inibidores de quinase não afectam a relação Nanog: Dnmt3b alterando a viabilidade do mESC. Utilizar relações classificadas de Nanog: Dnmt3b para identificar inibidores que promovam a pluripotência naïve (razão Nanog: Dnmt3b superior ao controlo) e pluripotência iniciada (razão Nanog: Dnmt3b inferior ao controlo). Defina o corte em 2x desvio dos valores de controle e filtre os inibidores de quinase que produzem um sinal Nanog + Dnmt3b total menor que50% do valor de controlo de DMSO para gerar uma lista de confiança elevada de inibidores de cinase que estabilizam os estados pluripotentes naïve (razão Nanog: Dnmt3b elevada) e iniciada (razão Nanog: Dnmt3b baixa). Validar inibidores de quinase semeando mESCs a 2 x 10 5 células por 6 poços em 2 mL de meio, e adicionar inibidores de cinase a 1 μM durante 48 h, sem alterar a mídia. Lyse mESCs em lise buffer e analisar Nanog e Dnmt3b expressão convencional SDS-PAGE immunoblotting. Validam ainda mais os resultados por imunotransferência de SDS-PAGE para marcadores de pluripotência níve Klf2 e Klf4 e Oct4 para assegurar que a pluripotência é mantida após 48 h de tratamento com inibidor.