높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

1. 작은 분자 키니 아제 억제 물 도서관의 분류 228 개의 강력하고 선택적 인 키나아제 억제제 (http://lincs.hms.harvard.edu)의 표본 모음 인 하버드 의과 대학의 Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) 라이브러리와 같은 대중적으로 접근 가능한 키나제 억제제 수집 물의 억제제 라이브러리를 대조하십시오. , 및 단백질 키나아제 억제 물 세트 (PKIS), 산업 연구원 (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS)에 의해 조립 된 376 화합물 수집 13 . 또는 상업적으로 이용 가능한 화합물로부터 주문품 키니 아제 억제제 수집 물을 조립하십시오. 참고 : 우리 실험실에서는 51 개의 1 차 표적 키나아제를 대상으로하는 72 개의 강력하고 선택적인 툴 키나제 억제제를 수집했으며, 모두 상업적 출처에서 입수 할 수 있습니다. 여러 농도에서 최적의 높은 처리량 처리를 위해 96- 웰 플레이트에 키나제 억제제를 조립하십시오 (1, 0.1 a0.01 mM). DMSO만을 함유하는 각 플레이트 대조구 및 대조군 인 PD173074 (FGFRi) 및 Ruxolitinib (JAKi)를 포함하며, 이들은 각각 순 진성 및 뇌하수체 성의 다 능성 상태를 촉진시키는 것으로 공지되어있다. 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어에 주석을 답니다. 2. 스크린 준비를위한 mESC 문화 조건 및 절차 10cm 플레이트에 0.1 % (w / v) 젤라틴 5 ML을 추가하여 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 요리를 준비하고 5 분 실온에서 부화. 흡 인물 젤라틴을 2 분 동안 건조시킨다. 100 ng / mL GST-LIF, 10 % 태아 송아지 혈청 및 5 % 녹아웃 혈청을 함유하는 표준 mESC 배지 ( 재료 표 참조)에서 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 37 ° C 5 % CO 2 에서 모든 표준 mESC 라인을 배양하십시오. 바꿔 놓음. 1 일 5 ~ 1시 10 분 희석으로 매일 매 80 % confluency에서 매초 및 통로 mESC를 교체하십시오. 통과 mESCs, 미디어를 대기음과 5 ML으로 씻어f 인산 완충 식염수 (PBS)를 함유한다. mESC의 플레이트 당 1 ML 트립신 – EDTA (0.05 % 트립신, 0.02 % EDTA)를 추가하고 37에서 품어 ° C 10 분. 5 분 1,200 rpm으로 mESC 미디어와 원심 분리기 4 ML의 Resuspend의 trypsinized 세포. 철저히 하나의 세포 현탁액을 생성하는 위아래로 pipetting mESC 미디어 5 ML에 세포 펠렛을 resuspend. 10 μL 세포 현탁액과 10 μL의 Trypan Blue (0.4 %)를 결합하여 세포를 계수하십시오. 세포 계수 챔버에 넣거나 hemocytometer와 가벼운 현미경을 사용하십시오. 멀티 채널 피펫을 사용하여 0.1 % 젤라틴 코팅 96 웰 플레이트, 최종 볼륨 100 μL에 3 X 10 3 mESC를 시드하십시오. 다중 채널 피펫을 사용하여 1 : 100 희석액 (1 μL 억제제를 100 μL 배지에 첨가)에 키나제 억제제를 적용하십시오. 부드럽게 혼합 방지제와 세포 현탁액에 미디어를 피펫, 그럼 세포가 균등 분배 acro 보장하기 위해 1 시간 동안 조직 문화 후드에 정착 수 있습니다도금 표면. 매체를 바꾸지 않고 48 시간 동안 배양 세포. 참고 : 1 / 0.1 / 0.01 mM의 스톡 플레이트는 각각 최종 저해제 농도가 10 / 1 / 0.1 μM이됩니다. off-target 효과를 최소화하면서 1 차 타겟 키나아제의 효과적인 억제를 보장하기 위해 1 μM의 최종 농도에서 스크린을 시작하는 것이 좋습니다. 3. 키나아제 억제제 스크리닝 분석 멀티 채널 흡인기 및 피펫을 사용하여 200 μL PBS로 96 well mESC 플레이트를 세척하십시오. 용해 버퍼 (20 MM 트리스 산도 7.4, 150 MM NaCl, 1 MM EDTA, 1 % NP – 40 (V / V), 0.5 % 나트륨 deoxycholate (W / V), 10 MM β – glycerophosphate , 10 mM 피로 인산 나트륨, 1 mM NaF, 2 mM Na3 VO4, 완전한 프로테아제 저해제 칵테일 정제). V-bottomed 96- 웰 플레이트에서 30 분 동안 1,500 xg에서 원심 분리하여 추출물을 명확히하십시오. 100㎕의 상청액을 nitrocel에 고정시킨다.96- 웰 진공 도트 블롯 매니 폴드 (blank dot manifot)를 사용하여 1 ㎛ 막에 코팅 하였다. 멤브레인을 건조시키고 Ponceau S 40 mL로 얼룩을지게하여 일관된 이동을 보장합니다. 멤브레인을 TBST로 씻고 TBST / 3 % (w / v) 우유로 차단하십시오. TBST / 3 % (w / v) 분유에서 1 : 1,000 (v / v) 희석하여 Nanog 및 Dnmt3b 항체를 밤새 품는다. TBST에서 3×10 분 동안 세포막을 씻고 1 : 10,000 (v / v)의 TBST / 3 % (w / v) 묽게 희석 한 2 차 항체 30 mL에서 배양하십시오. 디지털 면역 블 롯팅 이미징 시스템을 사용하여 개발하십시오. 참고 : 가능하면 Nanog 및 Dnmt3b를 검출하기 위해 정량 형광 면역 블로 팅을 사용하십시오. 그러나, 형광 immunoblotting에 의해 Dnmt3b에 대한 배경 신호가 너무 높습니다. 따라서, 800 nm 형광 항 – 토끼 (Nanog) 및 항 마우스 -HRP (Dnmt3b) 2 차 항체가 사용된다. 4. 선천성 만능 혈압 조절제로서 스크리닝 데이터 및 억제제의 검증 <p class="jove_content"> 참고 : 이것은 선의의 만능 분열 조절제 만 확인하는 중요한 단계입니다. mESC 생존에 악영향을 미치는 키나아제 억제제가 추가 분석을 위해 선택되지 않도록 Nanog : Dnmt3b 비율과 전체 신호에 기반한 억제제를 분류하는 것이 필수적입니다. Immobotting 분석 소프트웨어를 사용하여 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 정량화하고 값을 스프레드 시트 또는 유사한 소프트웨어로 가져옵니다. DMSO 대조군과 비교하여 모든 시료에 대해 Nanog : Dnmt3b 비율을 계산하십시오. 또한, 키나아제 저해제가 mESC 생존력을 변경하여 Nanog : Dnmt3b 비율에 영향을 미치지 않도록 총 Nanog 및 Dnmt3b 신호를 결정하십시오. Nanog : Dnmt3b 비율을 사용하여 순전 한 다 분화능 (Nanog : 대조군보다 높은 Dnmt3b 비율)과 primed pluripotency (Nanog : 대조군보다 낮은 Dnmt3b 비율)를 촉진하는 억제제를 확인하십시오. 제어 값으로부터 2 배 편차로 컷오프를 설정하고 전체 Nanog + Dnmt3b 신호를 생성하는 키나아제 억제제를 걸러냅니다(높은 Nanog : Dnmt3b 비율) 및 프라이밍 된 (낮은 Nanog : Dnmt3b 비율) 다 능성 상태를 안정화시키는 키나아제 저해제의 높은 신뢰도 목록을 생성하는 DMSO 대조군 값의 50 %. 2 mL 배지에서 6 well 당 2 x 10 5 세포에 mESC를 접종하여 키나아제 억제제를 검증하고 배지 교환없이 48 시간 동안 1 μM에서 키나제 억제제를 첨가하십시오. 용해 완충액에서 mESCs를 녹여 기존의 SDS-PAGE 면역 블로 팅으로 Nanog 및 Dnmt3b 발현을 분석합니다. 또한 naive pluripotency marker 인 Klf2와 Klf4, Oct4에 대한 SDS-PAGE immunoblotting으로 히트를 검증하여 48 시간 동안 억제제를 투여 한 후에 다 분화능이 유지되도록 하였다.