Un metodo semplice per identificare le cinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali mediante screening di inibitori ad alta percentuale

1. Collazione di librerie di inibitori di piccole molecole Librerie di inibitori di collazione di collezioni di inibitori di chinasi pubblicamente accessibili, ad esempio Biblioteca di Integrated Network Signature Cellular (LINCS) della Harvard Medical School, una raccolta mirata di 228 potenti e selettivi selettori di chinasi (http://lincs.hms.harvard.edu) , E il Set di inibitori della proteina (PKIS), una collezione composta 376 assemblata da ricercatori industriali (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . In alternativa, assemblare una raccolta di inibitori chinasi su misura da composti disponibili in commercio. NOTA: Nel nostro laboratorio abbiamo assemblato una raccolta di 72 inibitori potenti e selettivi di chinasi di attrezzi che coprono 51 chinasi di destinazione primarie, tutte disponibili da fonti commerciali. Assemblare inibitori di chinasi in piastre a 96 pozzetti per un'elaborazione ottimale di elevata produttività a diverse concentrazioni (usa 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Includere in ogni pozzetto di controllo delle piastre contenenti solo DMSO e inibitori di controllo di riferimento PD173074 (FGFRi) e Ruxolitinib (JAKi), che sono noti per promuovere rispettivamente stati pluripotenti naïve e primed. Annotare in un foglio di calcolo o un software simile. 2. Condizioni e procedure di cultura del mESC per la preparazione dello schermo Preparare i piatti da 10 cm di gelato rivestiti allo 0,1% aggiungendo 5 ml di gelatina 0,1% (w / v) a piastre da 10 cm e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aspirare la gelatina e lasciare la piastra secca per 2 min. Coltivare qualsiasi linea standard mESC a 37 ° C 5% CO 2 su 0,1% piastre rivestite in gelatina da 10 cm in media mESC media (vedi tabella materiali) contenenti 100 ng / ml GST-LIF, 10% fetale calf serum e 5% Knockout serum Sostituzione. Sostituire i supporti ogni giorno e passare i mESC a circa 80% confluenza ogni secondo giorno ad una diluizione di 1: 5-1: 10. Per passare i mESC, aspirare i supporti e lavare con 5 ml oF salina fosforata tamponata (PBS) per piastra. Aggiungere 1 mL di trysina-EDTA (0,05% di Trypsina, 0,02% EDTA) per piastra di mESC e incubare a 37 ° C per 10 minuti. Resuspendere le cellule trypsinizzate in 4 mL di supporto mESC e centrifugare a 1.200 giri / min per 5 min. Riposizionare completamente il pellet cellulare in 5 ml di media mESC, pipettando su e giù per generare una sospensione di una singola cellula. Contare le cellule combinando una sospensione cellulare di 10 μl e 10 μL di Trypan Blue (0,4%). Inserire in una camera di conteggio delle celle o utilizzare un emocytometro e un microscopio leggero. Sementi 3 x 10 3 mESC in piastre a 96 pozzetti rivestiti con gelatina del 0.1%, volume finale 100 μL di supporti, utilizzando una pipetta multicanale. Applicare inibitori di chinasi a diluizione 1: 100 (inibitore di 1 μl aggiunto a 100 μL di supporto) utilizzando una pipetta multicanale. Infine pipetta media per mescolare l'inibitore e la sospensione cellulare, quindi lasciare che le cellule si stabiliscano in una cappa di coltura tissutale per 1 h per garantire una distribuzione uniforme acroSs la superficie di placcatura. Le cellule di coltura per 48 h senza cambiare il supporto. NOTA: Le lastre di riserva di 1 / 0,1 / 0,01 mM daranno una concentrazione finale di inibitori rispettivamente di 10/1 / 0,1 μM. Si consiglia di avviare lo schermo ad una concentrazione finale di 1 μM per assicurare un'efficace inibizione delle chinasi di destinazione primaria riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio. 3. Analisi della screening di inibitori della chinasi Lavare le piastre mESC a 96 pozzetti in 200 μl di PBS usando aspiratore e pipette multicanale. Realizzare gli estratti di cellule in 150 μl di tampone di lisi (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% sodio deossicolato (w / v), 10 mM β-glicerofosfato , 10 mM di sodio pirofosfato, 1 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4 , Completi Compresi di Proteas Inhibitore Cocktail). Determinare gli estratti per centrifugazione a 1.500 xg per 30 minuti in piastre a 96 pozzetti a fondo V. Immobilizzare 100 μL di supernatanti su un nitrocelMembrana lulosa utilizzando un collettore a macchia a vuoto a 96 pozzetti. Asciugare la membrana e macchiare con 40 ml di Ponceau S per garantire un trasferimento costante. Lavare la membrana con TBST e bloccare il latte TBST / 3% (w / v). Incubare in anticorpi Nanog e Dnmt3b a una diluizione di 1: 1.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) di latte in polvere durante la notte. Lavare le membrane in 3 x 10 min in TBST e incubare in 30 mL di anticorpi secondari ad una diluizione di 1: 10.000 (v / v) nel latte TBST / 3% (w / v). Sviluppare utilizzando un sistema di imaging digitale immunoblotting. NOTA: se possibile, utilizzare l'immunoblotting quantitativo di fluorescenza per rilevare Nanog e Dnmt3b. Tuttavia, il segnale di fondo per Dnmt3b da immunoblotting a fluorescenza è troppo elevato. Pertanto, vengono impiegati anticorpi anti-coniglio (Nanog) e anti-mouse-HRP (Dnmt3b) a fluorescenza da 800 nm. 4. Analisi dei dati dello schermo e valida degli inibitori come regolatori pluripotenziali Bona Fide <p class="jove_content"> NOTA: Si tratta di un passo fondamentale per garantire che solo i moduli di pluripotenza in buona fede siano identificati. E 'essenziale per inibitori di triage basati sia sul rapporto Nanog: Dnmt3b che sul segnale complessivo, per garantire che gli inibitori di chinasi che influenzino negativamente la sopravvivenza del mESC non siano selezionati per ulteriori analisi. Quantificare il segnale Nanog e Dnmt3b utilizzando il software di analisi immunoblotting e importare i valori in un foglio di calcolo o in un software simile. Calcola il rapporto Nanog: Dnmt3b per tutti i campioni rispetto al controllo DMSO. Inoltre, determinare il totale del segnale Nanog e Dnmt3b per garantire che gli inibitori della chinasi non influenzino il rapporto Nanog: Dnmt3b modificando la vitalità del mESC. Utilizzare i rapporti Nanog: Dnmt3b per identificare gli inibitori che promuovono la pluripotenza ingenua (Nanog: rapporto Dnmt3b superiore al controllo) e la pluripotenza primaria (rapporto Nanog: Dnmt3b inferiore al controllo). Impostare il cut-off a 2 ° deviazione dai valori di controllo e filtrare gli inibitori di chinasi che producono un segnale totale Nanog + Dnmt3b inferiore aIl 50% del valore di controllo DMSO per generare un'elevata lista di fiducia degli inibitori di chinasi che stabilizzano stati pluripotenti a livello naïve (rapporto High Nanog: Dnmt3b) e primati (basso Nanog: Dnmt3b ratio). Validare gli inibitori della chinasi mediante la semina di mESC a 2 x 10 5 cellule per 6 pozzetti in 2 mL di media e aggiungere inibitori di chinasi a 1 μM per 48 h senza cambiare supporto. Lyse mESCs nel buffer di lisi e analizzare l'espressione di Nanog e Dnmt3b mediante immunoblotting convenzionale SDS-PAGE. Inoltre convalidare i colpi con l'immunoblotting SDS-PAGE per i marker naif pluripotenza Klf2 e Klf4 e Oct4 per assicurare che la pluripotenza sia mantenuta dopo un trattamento inibitore di 48 ore.