שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

1. איסוף של קטן מולקולה Kinase מעכבי ספריות איסוף ספריות מעכבות מאוספי מעכבי קינאז נגישים לציבור, כגון ספריית הרשתות המשולבות מבוססות רשת (LINCS) מבית הספר לרפואה של הרווארד, אוסף ממוקד של 228 מעכבי קינאז רבי עוצמה וסלקטיביים (http://lincs.hms.harvard.edu) , ואת Proinin Kinase inhibitor Set (PKIS), אוסף 376 המתחם התאספו על ידי חוקרים תעשייתיים (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . לחלופין, להרכיב אוסף מעכב קינאז מעכב מתוך תרכובות זמין מסחרית. הערה: במעבדה שלנו, יש לנו התאספו אוסף של 72 מעכבי קינאז כלי חזק סלקטיבי המכסים 51 קינאזות היעד העיקרי, כל אלה זמינים ממקורות מסחריים. להרכיב מעכבי קינאז לתוך צלחות 96-היטב עבור עיבוד תפוקה גבוהה אופטימלית בריכוזים מרובים (השתמש 1, 0.1 aNd 0.01 מ"מ). כלול בכל בארות בקרת צלחת המכילה DMSO בלבד מעכבי בקרה התייחסות PD173074 (FGFRi) ו Ruxolitinib (JAKi), אשר ידועים לקדם מדינות pluripotent נאיבי מתוחכם בהתאמה. הוסף הערות בגיליון אלקטרוני או בתוכנה דומה. 2. mESC תנאי התרבות והנהלים להכנת מסך הכן 0.1% ג 'לטין מצופה 10 ס"מ מנות על ידי הוספת 5 מ"ל של 0.1% (w / V) ג' לטין עד 10 צלחות ס"מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לשאוב ג'לטין ולתת צלחת יבש במשך 2 דקות. תרבות כל קו mESC רגיל ב 37 ° C 5% CO 2 על 0.1% ג 'לטין מצופה 10 ס"מ מנות בתקשורת mESC סטנדרטי (ראה טבלה חומרים) המכיל 100 ng / mL GST-LIF, 10% עגל סרום סרום 5% סרום נוקאוט תַחֲלִיף. החלף מדי יום את התקשורת ואת mESCs המעבר סביב confluency 80% בכל יום שני בדילול של 1: 5-1: 10. כדי לעבור mESCs, לשאוב התקשורת לשטוף עם 5 מ"ל oF פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לכל צלחת. הוסף 1 מ"ל טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין, 0.02% EDTA) לכל צלחת של mESCs ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. Resuspend תאים trypsinized ב 4 מ"ל של התקשורת mESC ו צנטריפוגה בסל"ד 1,200 במשך 5 דקות. ביסודיות resuspend תא גלולה ב 5 מ"ל של התקשורת mESC, pipetting למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה תא בודד. ספירת תאים על ידי שילוב של השעיה 10 תא μL ו 10 μL של Trypan כחול (0.4%). מקום לתא ספירה תא או להשתמש hemocytometer ומיקרוסקופ אור. זרע 3 x 10 3 mESCs לתוך 0.1% ג'לטין מצופה 96 צלחות היטב, נפח סופי 100 μL של התקשורת, באמצעות פיפטה רב ערוצי. החל מעכבי קינאז ב דילול 1: 100 (מעכב 1 μL הוסיף 100 Media μL) באמצעות פיפטה רב ערוצי. בעדינות פיפטה התקשורת לערבב מעכב ההשעיה תא, ולאחר מכן לאפשר תאים להתיישב ברדס תרבות רקמה עבור 1 שעות כדי להבטיח את הפצה שווה אקרוSs משטח ציפוי. תרבות תאים במשך 48 שעות מבלי לשנות את התקשורת. הערה: לוחות מלאי של 0.1 / 0.1 / 0.01 מ"מ ייתן ריכוז מעכב סופי של 10/1 / 0.1 מיקרומטר בהתאמה. אנו ממליצים להתחיל את המסך בריכוז סופי של 1 מיקרומטר כדי להבטיח עיכוב יעיל של קינאזים היעד העיקרי תוך מזעור מחוץ לכוון השפעות. 3. קינאז מעכבים ניתוח הקרנה לשטוף 96 צלחות mESC גם 200 μL PBS באמצעות אספירטור רב ערוצי ו pipettes. הפוך את תמציות התא μL 150 של חיץ תמוגה (20 מ"מ טריס pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0.5% נתרן deoxycholate (w / v), 10 מ"מ β-glycerophosphate , 10 מ"ל pyrophosphate נתרן, 1 NaF mM, 2 mM Na 3 VO 4 , Protease מעכב שלם קוקטייל טבליות). להבהיר תמציות על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 דקות V- התחתונה 96 צלחות היטב. Immobilize 100 μL של supernatants על nitrocel קרום lulose באמצעות 96-גם ואקום נקודה כתם סעפת. יבש את הממברנה, ואת הכתם עם 40 מ"ל של Ponceau S כדי להבטיח העברה עקבית. לשטוף קרום עם TBST ולחסום ב TBST / 3% (w / V) חלב. דגירה בננוג ו Dnmt3b נוגדנים בדילול של 1: 1000 (v / v) ב TBST / 3% (w / v) אבקת חלב לילה. לשטוף את הממברנות ב 3 x 10 דקות ב TBST ו דגירה ב 30 מ"ל של נוגדנים משניים בדילול של 1: 10,000 (v / v) ב TBST / 3% (w / V) חלב. לפתח באמצעות מערכת דיגיטלית immunoblotting הדמיה. הערה: אם אפשר, להשתמש immunoblotting פלואורסצנטי כמותי כדי לזהות Nanog ו Dnmt3b. עם זאת, האות הרקע של Dnmt3b על ידי immunoblotting פלואורסצנטי גבוה מדי. לכן, 800 ננומטר פלואורסצנטי נגד ארנבת (ננוג) ו anti-mouse-HRP (Dnmt3b) נוגדנים משניים משמשים. 4. ניתוח של נתוני המסך ו אימות של מעכבים כמו רגולטוריים plaipipotency בתום לב <p class="jove_content"> הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח כי רק מאפננים ploreipotency בתום לב מזוהים. זה חיוני מעכבי triage מבוסס על שניהם Nanog: יחס Dnmt3b ואת האות הכולל, כדי להבטיח כי מעכבי קינאז אשר משפיעים לרעה הישרדות mESC לא נבחרו לניתוח נוסף. לכמת ננוג האות Dnmt3b באמצעות תוכנת ניתוח immunoblotting, ואת ערכי ייבוא ​​לתוך גיליון אלקטרוני או תוכנה דומה. חישוב ננוג: יחס Dnmt3b עבור כל דגימות לעומת שליטה DMSO. כמו כן, לקבוע את סך Nanog ו Dnmt3b האות כדי להבטיח כי מעכבי kinase לא משפיעים על Nanog: Dnmt3b יחס ידי שינוי mESC הכדאיות. השתמש דירוג ננוג: יחסי Dnmt3b לזהות מעכבים אשר לקדם את pluripotency נאיבי (Nanog: Dnmt3b יחס גבוה יותר מאשר שליטה) ו ploripotency מתוחכם (Nanog: Dnmt3b יחס נמוך יותר מאשר שליטה). הגדר לחתוך סטייה 2x מערכי הבקרה, לסנן מעכבי kinase אשר מייצרים סך Nanog + Dnmt3b האות פחות מזה50% מערך הבקרה DMSO כדי ליצור רשימת אמון גבוהה של מעכבי קינאז אשר מייצב נאיבי (גבוה Nanog: Dnmt3b יחס) ו מתוחכם (נמוך Nanog: Dnmt3b יחס) pluripotent מדינות. אימות מעכבי קינאז ידי זריעת mESCs ב 2 x 10 5 תאים לכל 6 היטב התקשורת 2 מ"ל, ולהוסיף מעכבי קינאז ב 1 מיקרומטר במשך 48 שעות, ללא שינוי התקשורת. Lyse mESCs במאגר תמוגה ולנתח ביטוי Nanog ו Dnmt3b ידי immunoblotting SDS-PAGE קונבנציונאלי. עוד לאמת את הלהיטים על ידי SDS-PAGE immunoblotting עבור סמנים pluripotency נאיבי Klf2 ו Klf4, ו Oct4 כדי להבטיח כי pluripotency נשמר לאחר טיפול 48 שעות מעכב.